Práctica 16: Southern Blot

1. ELECTROFORESIS DEL GEL DE AGAROSA

a) Preparar el gel

Preparar un gel de agarosa al 0,8% para la electroforesis de las muestras lista para ser sembradas. Utilizar  un  gel  de  7x7  cm  o  7x10  cm.  Se  necesitan  6  pocillos  con  una capacidad de 40 µl.

b) Antes de la siembra de las muestras

1. En  un  baño  calentar  un  vaso  a  65ºC  para  calentar  las  muestras  que  contienen  el  ADN antes de su siembra. A 65ºC las agregaciones no específicas que se pueden generar por los extremos cohesivos generados por los enzimas de restricción son eliminadas.
2. Calentar las muestras A-E a 65ºC durante 2 minutos. Permitir enfriar las muestras otros 2 minutos.

c) Sembrar las muestras

Sembrar  las  muestras  A-E  en  pocillos  consecutivos.  La  cantidad  de  muestra  a  siembra debe ser de 35-58 µl.

d) Correr el gel

1. Después  de  la  siembra,  configurar  la  fuente  de  electroforesis  al  voltaje  requerido.  Una vez terminada la electroforesis proceder con el análisis de Soutern Blot.
2. La  electroforesis  debería  pararse  cuando  el  colorante  naranja  de  carga  haya  migrado aproximadamente 4,5 cm desde el pocillo de siembra del gel de agarosa.

2. ANÁLISIS DE SOUTHERN BLOT

Durante este proceso se transferirán los fragmentos de ADN desde el gel de agarosa a la membrana de nylon. Después de la trasferencia, la membrana será incubada durante un periodo  corto  de  tiempo para  fijar  el  ADN  a  la  membrana.  Para  evitar  reactivos TOXICOS,  y  especialmente  los  radioactivos, que  son  utilizados  en  el  Southern, en  este  experimento  se  utilizará  un  sistema  de  detección  no isotópico especialmente diseñado para su uso escolar.

a) Despurinización/Desnaturalización

1. Después  de  la  electroforesis,  el  gel  es  secuencialmente  tratado  con  HCl  y  NaoH.  El  HCl introduce sitios  apurínicos  en  el  ADN  lo  cual  produce  uniones  fosfodiester  e  introduce “nicks”  en  el  ADN de  doble  cadena.  El  tratamiento  con  NaOH  rompe  los  puentes  de hidrógeno  entre  las  bases.  El secuencial  tratamiento  ácido/base  resulta  en  la  formación de  pequeños  fragmentos  que  facilita  la trasferencia  de  los  fragmentos  de  ADN  en  la membrana de nylon.
2. Después  de  la  electroforesis  colocar  el  gel  de  agarosa  en  una  cubeta  con  100  ml  de 0,25  N HCl.  Incubar  a  temperatura  ambiente  durante  8  minutos  (no  sobrepasar  este tiempo).  El  gel  debe estar  completamente  cubierto  con  la  solución  y  agitar periódicamente.
3. Eliminar  con  cuidado  la  solución,  que  no  se  podrá  reutilizar.  Lavar  el  gel  con  diversos cambios de 100 ml de agua destilada.
4. Colocar el gel durante 15 minutos en la solución  de Desnaturalización del ADN (0,5 M NaOH/0,6  M NaCl).  El  gel  debe  estar  completamente  cubierto  con  la  solución  y  agitar periódicamente. Eliminar la solución.
5. Utilizar  otros  100  ml  de  Solución  de  Desnaturalización  e  incubar  otros  15  minutos. Conservar está solución para el punto 6.
6. Configurar la transferencia del Southern Blot
7. Colocar  unas  hojas  de  papel  de  plástico,  de  aluminio  o  papel  “whatman”  en  una superficie plana del laboratorio. Sacar el gel e invirtiendo el gel (los pocillos hacia abajo), colocar  la  superficie  lisa de  forma  que  quede  en  contacto  con  la  membrana  de transferencia.
8. Utilizando  siempre  guantes,  con  pinzas  y  tijeras  ajustar  la  membrana  de  nylon  al tamaño del gel. Aquellas zonas de la membrana tocadas sin guantes dejarán residuos de aceite  y  no  permitirán unir  el  ADN  durante  la  transferencia.  Muchos  guantes  contienen polvo lo que aumentará el “background” en la membrana, colocarse los guantes y lavarse con agua para eliminar el polvo.
9. Recoja con mucho cuidado la membrana por los extremos con 2 pinzas y ligeramente doblada  en  el centro  y  lentamente  humedecer  (desde  la  mitad  hacia  afuera)  con  la solución de Desnaturalización del punto 4.
10. Liberar  la  membrana  y  sumergir  suavemente  durante  5  minutos  en  la  solución  de Desnaturalizción.  Utilizando  unas  pinzas  sacar  la  membrana  saturada  de  la  Solución  de Desnaturalización y colocarla encima del gel de agarosa.
11. Es  MUY  IMPORTANTE  que  entre  los  diferentes  elementos  del  dispositivo  no queden burbujas de aire.
12. Recorte  el  papel  de  filtro  de  blotting  del  mismo  tamaño  del  gel  y  la  membrana  de nylon. Colocar  el  papel  de  filtro  encima  de  la  membrana.  Cuidadosamente,  colocar  un montón de papel absorbente 4-5 cm de grosor encima del filtro de “blotting”. Colocar una bandeja o placa de cristal y colocar por ejemplo un vaso de 400 ml vacío como peso.
13. Permitir que la transferencia progrese durante 4 horas o toda la noche.
14. Eliminar la placa de vidrio, vaso y papeles absorbentes.
15. Con  guantes  enjuagados  y  pinzas  voltear  el  conjunto  (gel-nylon-papel  de  filtro)  de forma que descanse sobre el papel de filtro.
16. Utilizando  un rotulador  dibujar  los 6 pocillos de muestra  y rastrear  sus posiciones  en la membrana de nylon
17. Utilizando  pinzas  retirar  el  gel  de  la  membrana.  El  gel  puede  ser  descartado  y  se observará que está deshidratado
18. Poner la membrana encima de un montón de papel seco con el ADN  hacía arriba (el lado que estuvo en contacto con el gel).
19. Marcar la membrana por el lado del ADN con el nº de grupo o nombre
20. Para  unos  resultados  óptimos,  secar  y  fijar  el  ADN  completamente  a  la  membrana.
21. Para ello colocar la membrana entre dos hojas de papel de filtro y colocar a 80ºC durante 30 minutos.

3. DETECCIÓN NO-ISOTÓPICA DEL ADN

1. Durante  este  proceso  se  podrá  visualizar  el  ADN  en  la  membrana.  El  “Blue  Blot  DNA Stain”  es un  reactivo  no-isotópico  desarrollado  para  su  uso  a  nivel  escolar,  que  elimina los problemas asociados al uso de isótopos radiactivos.
2. Colocar  la  membrana  con  el  ADN  en  100  ml  de  la  solución  diluida de  “Blue  Blot  DNA Stain” durante 10-15 minutos.
3. Sacar la membrana con pinzas y colocar en 200 ml de agua destilada.
4. Cambiar  el  agua  destilada  3  o  4  veces  hasta  que  la  membrana  está  desteñida  y  las bandas de ADN son claramente visibles.

 

RESULTADOS Y PREGUNTAS

Los  resultados  reales  producen  bandas  más  amplias  de  diferentes  intensidades.  El esquema muestra las posiciones relativas aproximadas de las bandas pero los resultados no están descritos a escala. Alguna de las bandas pequeñas puede no ser visible.

Pocillo1 A: Fragmentos estándar ADN

Pocillo2 B: ADN de madre cortado con enzima.

Pocillo3 C: Hijo cortado con enzima.

Pocillo4 D: Padre 1 cortado con enzima.

Pocillo5 E: Padre 2 cortado con enzima.

Preguntas previas

1. ¿Por qué el Southern Blot es un análisis requerido para pruebas forenses o de paternidad? 

La  digestión  de  los  cromosomas  humanos  con  enzimas  de  restricción produce  gran  cantidad  de fragmentos  de  ADN  que  no  pueden  ser  separados  por electroforesis  convencional.  Además,  los geles  son  difíciles  de  almacenar  y  frágiles  para exponer  a  agentes  desnaturalizantes.  La transferencia  de  las  bandas  de  ADN  a  una membrana  de  nylon  produce  una  imagen  espejo  de los  fragmentos  de  ADN.  De  esta forma los fragmentos transferidos a la membrana pueden ser desnaturalizados.

2.  ¿Cuál  es  la  función  de  las  sondas  en  el  análisis  de  paternidad? 

Sondas específicas  pueden  ser  desarrolladas  para  determinar  la  presencia  de  los  lugares  de restricción.  Las  sondas  pueden  hibridar  con  uno  o  más  fragmentos  generados  por  los enzimas de restricción.

3. ¿Por qué se utiliza más de un locus en un test de paternidad?

Se utilizan varias sondas para asegurar que el test determina diferentes diferencias alélicas en un individuo dado que se puede correlacionar con la suma tanto de su padre y su madre.

4. ¿Cuál es el padre en esta prueba de paternidad?

 Padre 1.

5. ¿Se demuestra que la madre también es la madre biológica?

Sí.

Práctica 15: Secuenciación automática del genoma humano

OBJETIVO

En esta práctica, los estudiantes leerán secuencias de ADN obtenidos a partir de técnicas de secuenciación automáticas de ADN. Los datos se analizaron utilizando las bases de datos disponibles al público para identificar los genes y productos genéticos. El impacto de la genómica se discutirá en el contexto de la sociedad actual.

COMPONENTES

Esta práctica contiene un total de doce fragmentos de secuencias de ADN obtenidas automáticamente. Los estudiantes pueden usar cualquier base de datos de secuencias del Genoma Humano para llevar a cabo la práctica. En este protocolo se ha utilizado la base de datos ofrecida por el Centro Nacional de Información Biotecnológica, NCBI (National Center for Biotechnology Information).

• Fragmentos de secuencias de ADN     12
• Material requerido y no suministrado
• Ordenador con acceso a internet.

DESCRIPCIÓN DEL EXPERIMENTO

En esta práctica, los estudiantes leerán secuencias de ADN obtenidos a partir de técnicas de secuenciación automáticas de ADN. Los datos se analizaron utilizando las bases de datos disponibles al público para identificar los genes y productos genéticos. El impacto de la genómica se discutirá en el contexto de la sociedad actual.

Consideraciones previas

Los estudiantes pueden usar cualquier base de datos de secuencias del Genoma Humano para llevar a cabo la práctica. Para la realización de este protocolo se ha utilizado la base de datos ofrecida por el Centro Nacional de Información Biotecnológica, NCBI (National Center for Biotechnology Information).

PROTOCOLO

1. Escriba: www.ncbi.nlm.nih.gov para iniciar sesión en la página web del NCBI.
2. En la parte superior izquierda de la pantalla, haga clic en el apartado “Resources” (Recursos) del menú desplegable.
3. Haga clic en “Data and software” (Datos y software), a continuación, haga clic en “BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)”.
4. En la nueva pantalla de inicio, seleccione “Nucleotide blast” (Nucleótido blast), que es la primero opinión en la lista de “BLAST Basic”.
5. En la nueva pantalla asegúrese de que la pestaña seleccionada es “BLASTN”.
6. Introduzca la secuencia de nucleótidos en la caja grande en la sección “Enter Query Sequence” (“Entrar secuencia a consultar”); tenga cuidado al escribir la siguiente secuencia exactamente: ggcaactgcccaaagtgtgatccagcctgtctcaacagaa
7. En “Choose Search Set” (Elija conjunto de búsqueda) asegúrese que se ha seleccionado “Others (nr etc)” (Otros (nr etc.)) y que “Nucleotide collection (nr/nt)” (Colección de nucleótidos (nr/nt)) aparece en el menú desplegable. Las entradas restantes deben dejarse en blanco.
8. En la sección “Program Selection” (Selección del programa) seleccionar “Highly similar sequence (megablast)” (Secuencia de alta similitud (megablast)).
9. Haga clic en el cuadro de consulta azul "BLAST".
10. Una vez que se ha hecho click en el cuadro de búsqueda "BLAST", se le asignará un ID#. Anote este número para poder comprobar los resultados en un momento posterior.
11. Examine el informe de búsqueda BLASTN. El informe incluye:
12. Informe Resumen de Búsqueda muestra una visión general de los parámetros de la búsqueda BLASTN.
13. Sección del Gráfico Resumen muestra la alineación de las coincidencias de la base de datos con la secuencia de consulta. El color de las cajas corresponde a la puntuación de la alineación, siendo el rojo el que representa las puntuaciones de alineación más altas.
14. Sección de Descripción muestra todas las secuencias de la base de datos que presentan una homología significativa con nuestra secuencia. Por defecto, los resultados se clasifican de acuerdo con el “E-Value” (Valor E), pero puede hacer clic en el encabezado de columna para ordenar los resultados según diferentes categorías. Observe que puede haber varias entradas diferentes con una idéntica puntuación alta.
15. Sección de Alineamiento muestra bloques con los alineamientos de cada “hit” del programa BLAST. Cada bloque de los alineamientos comienza con un resumen que incluye la “Max score” (puntuación máxima) y el valor esperado, la identidad de la secuencia, el número de huecos en el alineamiento, y la orientación de la secuencia de consulta con respecto a la secuencia sujeto.
16. Seleccione una secuencia para centrarse en un análisis más profundo de la misma. Para ello, hacer clic en una barra de color en la sección de Gráfico Resumen, o hacer clic en el nombre de la secuencia en la sección de Descripción, o desplácese hacia abajo a la sección de Alineamiento. A continuación, hacer clic en el identificador de secuencia. Esto nos lleva a obtener información adicional acerca de la secuencia sujeto, incluyendo el nombre del gen, el género y la especie de origen, y artículos escritos sobre el gen. Después de realizar esta búsqueda, uno de los “hits” debe ser Bos taurus epidermal growth factor receptor (EGFR), mRNA (Bos taurus factor de crecimiento epidérmico (EGFR), ARNm). Secuencia ID: Ref |XM_002696890.4|. Si la parte superior del hit no coincide, volver a entrar la secuencia. Asegurarse que los parámetros de la búsqueda del BLASTN son los correctos.

A) Ejercicios

Ejercicio 1

Ahora que está familiarizado con el proceso de inscripción y presentación de BLAST, lea el análisis de la secuencia de ADN de la copia impresa del gel (cualquier carril) y encuentre el gen que identifica esta huella. Para hacer esto:

Identificar la secuencia de nucleótidos (nucleótidos 100-200) a partir de la lectura de la secuencia de ADN.

Escriba al menos 70 bases en el cuadro de consulta del programa BLAST en la página web del NCBI. Las bases pueden ser de cualquier región de la secuencia, pero deben ser contiguas.

Examinar el informe de búsqueda BLASTN, identificar un gen probable, y examinar la identificación de genes para obtener información detallada.

Una vez que el gen ha sido identificado, responda a las siguientes preguntas:

1. ¿Cuál es el nombre de este gen?
2. En comparación con la entrada GenBank, ¿Qué cadena has leído?
3. ¿Se puede encontrar algún artículo escrito sobre este gen? Anote el nombre de uno de los autores que han contribuido.
4. Al identificar una enfermedad causada por mutaciones en este gen. ¿Cuáles serían los motivos de un médico para realizar una búsqueda para esta enfermedad? ¿Y si quien realiza la búsqueda es una compañía de seguros?

Recuerde lo siguiente:

• La secuencia automatizada diferencia las bases de la siguiente manera: A es de color verde, C es azul, G es negro, y T es rojo.
• El ADN es de doble cadena y contiene una parte superior (5'→3') e inferior (3'→5') cadena (a veces esto corresponde a las hebras de codificación y no codificantes). Una secuencia de ADN se introduce siempre en la dirección 5'→3'.
• A veces es difícil de leer un pico de nucleótidos. Esto es particularmente cierto en al principio y al final de una secuencia de lectura donde los picos pueden superponerse. Estos lugares de difícil identificación a menudo son etiquetados con una N en lugar de con uno de los cuatro nucleótidos. Generalmente, es mejor saltar secciones con una gran cantidad de N’s.
• Debido a que los investigadores pueden llamar a los mismos genes con diferentes nombres, pueden existir varias posibilidades para cada secuencia.
• Al hacer clic en el número de acceso de GenBank se puede acceder a información adicional, como la secuencia de proteína/aminoácidos, la descripción de la secuencia/gen, y los que contribuyen los nombres científicos.
• Algunas de las secuencias que tienen una puntuación elevada pueden predecir genes que no tienen ningún trabajo de investigación relacionados con ellos. Los estudiantes pueden tener que revisar varios emparejamientos antes de que hallar una secuencia con una referencia asociado.
• Ejercicio 2
• Intercambiar la copia de secuencia automática con otro grupo y enviar la secuencia de análisis BLAST. Anote el gen. Seleccione una secuencia asociada a un documento publicado, grabar el título y el primer autor del artículo.
• ¿Qué es la bioinformática? ¿Cómo han avanzado en la tecnología de secuenciación en este campo?
• Nombre dos métodos de secuenciación y describir el compromiso entre la velocidad de producción y la longitud de las secuencias producidas.
• ¿Qué suposición hace BLAST? ¿Cuáles son las ventajas y desventajas de hacer esta suposición?

RESULTADOS

La transducción de señales es un proceso importante por el que los receptores de las células actúan como amplificadores de la señal. La membrana de la superficie celular contiene sensores moleculares complejos que reciben, amplifican y reaccionan a señales extracelulares implicadas en el crecimiento y la diferenciación celular. La pérdida de capacidad de una célula para reaccionar a estas señales puede dar lugar a la transformación celular y la aparición de diversos tipos de cáncer.

El conjunto de tres secuencias corresponden a los nucleótidos de distintos genes que están funcionalmente relacionados y juegan un papel importante en la transducción de señales. La identidad de estos genes (y sus proteínas producto) puede determinarse utilizando la página web de NCBI como se ha descrito anteriormente en esta práctica. Tenga en cuenta que los detalles sobre identificación de genes, cadena, referencias e información sobre el autor, serán diferentes dependiendo del punto en que se centre el estudiante. Sin embargo, cada gen debe coincidir con la información básica que se presenta a continuación. Después de investigar las posibles enfermedades relacionadas con estos genes, los estudiantes pueden discutir los temas bioéticos relacionados.

Secuencia de ADN 1

Línea 1: 

GNNNNNTGGNNNNNNNATANTTGCGGCCGCGGTTTTNTTTTTTTNTTNNNCNNGGAGCACAANCNAATGNANTGTGTTGTTGTGGCGARGGC-

GARGGCGCCGTTHHTAAAACTGTCTCCTGATATCCTACACAACAAACAAATTTCAT

Línea 2: 

CGGAGTATGTACCGACTGTTTTTGACAACTATGCAGTCACAGTTATGATTGGTGGAGAACCATATACTCTTGGACTTTTTGATACTGCAGGGCAAGTTATGA-

CAGATTACGACCGCTCACTTATCCACAAACAG

Línea 3: 

ATGTATTTCTAGTCTGTTTTTCAGTGGTCTCTCCATCTTCATTTGAAAACGTGAAAGAAAAGTGGTGCCTGAGATAACTCACCACTGTCCAAGACNCCTTTCTT-

GCTTGTTGGGACTCAAATTGATCTCAACGAGATGACCC

Línea 4: 

CTCTACTATTGAGAAACTTGCCAAGAACAAACAGAAGCCTATCACTCCANAGACTGGGTGAAAAGCTGGCCCGTGACCTGAANGCNGTCAAAGTATGTG-

GAGTGTTCTGCACTTACACAGCAGANGTCTGAAAAATGTGTTNATGAAGC

Secuencia 1: Ciclo de división celular 42 (proteína de unión a GTP) o CDC42 La CDC42 es una molécula reguladora intracelular clave que está implicada en la forma de la célula. En células de mamíferos, la proteína CDC42 regula el citoesqueleto de actina (el andamiaje de una célula) para producir una estructura filamentosa llamada filopodio, que están implicadas en la detección de otras células y el movimiento celular. Las mutaciones en CDC42 y sus proteínas asociadas se correlacionan con ciertos tipos de cáncer.

Secuencia de ADN 2 

Línea 1: 

TGCNNNNNTGGNTNNGGNNNNNATTGNNTCNCTNTACCATGCNNGNGCACAANGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTG

GGCAAAGCGTACAAAGGTTC-

CAAGGGACAGGACCAAGAACGAGGGGCTGAGACATTTACAACAGCAGGCATT

NOTA: Para obtener los mejores resultados, se recomienda la eliminación de los primeros 73 nucleótidos (en rojo) en el análisis de este carril.

Línea 2: 

TTTCTCTTCCTCTTCTTCACGGGAGGCGGGCANAGGACTGCTCGGATCGCTTCGTCAAACACTGTCTTGAGGCCTN

CTGTGTGAGCGCCGAGCACTCCAG-

GTATTTTACAGCACCAATCTCCTTANCCATGGCTANAC

Línea 3: 

CCCTGCGGATAGGTGATGGGAGTCAGCTTCTTCBCCTTCAGTTTCNCNATCGTGTCTTTATCATCCCTAAGATCAA

GTTTAGTTCCCACTANGATGATGGGAGT-

GTTGGGACAGTGGTGCCGCACCTCAGGATACCACTT

Línea 4: 

TGCACGGACATTTTCAAATGATGCAGGACTCACAAGGGAAAAGCAAATTAAGAACACATCTGTTTGCGGATAGGA

TAGGGGGCGTATTCTGTCATA-

ATCTTCTTGTCCAGCTGTATCCCAAAAAGCCCAGATTCACCGGTTT

Secuencia 2: Ras relacionada con toxina botulínica C3 substrato 1 (familia rho, pequeña unión GTP de proteína Rac1) o RAC1.

El gen RAC1 para una proteína reguladora que altera el citoesqueleto de actina para producir ondulaciones en la membrana, importantes para la motilidad celular. RAC1 es importante en un gran número de enfermedades, incluyendo el cáncer. Muchos tumores utilizarán la señalización RAC1 para conseguir un aumento de la motilidad y la capacidad invasiva, una de las primeras etapas requeridas para que el cáncer pueda propagarse por todo el cuerpo.

Secuencia de ADN 3

Línea 1: TGNNNNNNTGNNNNNNNGNNANAACGAAGTGCAGACTCAAAAGTGCCATCTCCCTCCCGACCATTGGAGGATC

CCAAGCTCTATGTTGCCCTTATTGT-

CACCAGTGACATTTAATTCCAAACAGGAGTCCTTCGGGCCAGCAA

Línea 2: 

GCTGCCCAGGCTTAGCTGCGAGCCCGTCATGGAGGAAAAAAGCTCAGGAGAAAACCAGTCTGTTGGAGAATGGG

ACAGTCCACCAGGGAGACACCTC-

GTGGGGCTCCAGCGGTTCTGCATCTCAGTCCAGCCAAGGCAGA

Línea 3: 

GACAGCCACTCCTCCAGCCTGTCCGAACAGTACCCCGACTGGGCCAGCCGAGGACATGTTTGACCATCCCACCCC

ATGCGAGCTCATCAAGGGGAAAGAC-

TAAGTCAGAGGAGTCCCTCTCTGACCTTACAGGTTCCCTCCCTCCTCTCC

Línea 4: CCTGCAAGCTTGATCTTGGGCCCTCACTTTTGGATGANGTGCTGAATGTTATGGATAAAAATAAGTAACTCGAGC

ATGCATCTAGAAGGGCCTATTCTATA-

ATGTCACCTAAATGCTAAACCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCNT

NOTA: Para obtener los mejores resultados, se recomienda la eliminación de los primeros 70 nucleótidos (en rojo) en el análisis de este carril.

Secuencia 3: proteína efectora CDC42 (Rho GTPasa vinculante) 3 o CDC42EP3 La CDC42 (secuencia 1) regula la formación de estructuras que contienen F-actina, mediante su interacción con diferentes proteínas efectoras. La CDC42EP3, una de estas proteínas efectoras, está implicada en la unión a la proteína CDC42, provocando cambios en la forma de una célula. Una célula detecta señales del ambiente externo mediante la creación de redes de moléculas de transmisión que indican a la célula cómo responder a dichas señales externas. Los defectos en estas moléculas de transmisión están implicados en muchas enfermedades, incluyendo cáncer.

Práctica 14: ADN - Informático

OBJETIVO

En esta práctica, los estudiantes explorarán la popular herramienta BLAST bioinformatics. En primer lugar se leerán las autorradiografías de secuenciaciones automáticas de geles. A continuación, se analizaran los datos resultantes utilizando las bases de datos disponibles al público (BLAST) para identificar los genes y productos genéticos.

COMPONENTES

Esta práctica contiene un total de 3 series de 4 autorradiografías de secuenciaciones automáticas de geles. Los estudiantes pueden utilizar cualquier base de datos de secuencias para llevar a cabo las actividades de esta práctica En este protocolo se ha utilizado la base de datos ofrecida por el Centro Nacional de Información Biotecnológica, NCBI (National Center for Biotechnology Information).

COMPONENTES

1. Autorradiografías de secuenciaciones automáticas de geles          3 grupos de 4 autorad.
2. A) Material requerido y no suministrado
3. Una computadora con acceso a Internet.
4. White Light Box (caja de luz blanca).

NOTA: Se recomienda como caja de luz blanca el sistema EDVOTEK GelVisualization Luz Blanca, ya que consideramos que es muy adecuado para esta práctica.

NOTA: Las autorradiografías también pueden ser colocadas en un retroproyector y ser mostradas a toda la clase.

DESCRIPCIÓN DEL EXPERIMENTO

En esta práctica, los estudiantes explorarán la popular herramienta BLAST bioinformatics. En primer lugar se leerán las autorradiografías de secuenciaciones automáticas de geles. A continuación, se analizaran los datos resultantes utilizando las bases de datos disponibles al público (BLAST) para identificar los genes y productos genéticos.

PROTOCOLO

A) Guía para el uso de BLASTN

1. Escriba: www.ncbi.nlm.nih.gov para iniciar sesión en la página web del NCBI.
2. En la parte superior izquierda de la pantalla, haga clic en el apartado Resources” (Recursos) del menú desplegable.
3. Haga clic en "Data & Software” (Datos y software), a continuación, haga clic en “BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)”.
4. En la nueva pantalla de inicio, seleccione "nucleotide blast” (Nucleótido blast), que es la opinión primera opción de la lista “BLAST Basic”.
5. En la nueva pantalla asegúrese de que la pestaña seleccionada es "BLASTN".
6. Introduzca la secuencia de nucleótidos en la caja grande en la sección "Enter Query Sequence” (Entrar secuencia a consultar); tenga cuidado al escribir la siguiente secuencia exactamente:                                                                                ggcaactgcccaaagtgtgatccagcctgtctcaacagaa
7. En “Chosse Search Set” (Elija conjunto de búsqueda) asegúrese que se ha seleccionado “Others (nr etc.)" (Otros (nr etc.)) y que "Nucleotide collection (nr/ nt)” (Colección de nucleótidos (nr/nt)) aparece en el menú desplegable. Las entradas restantes deben dejarse en blanco.
8. En la sección "Program Selection” (Selección del programa) seleccionar “Highly similar sequences (megablast)" (Secuencia de alta similitud (megablast)).
9. Haga clic en el cuadro de consulta azul "BLAST".
10. Una vez se ha hecho click en el cuadro de búsqueda "BLAST", se le asignará un ID#. Anotar este número para poder comprobar los resultados en un momento posterior.
11. Examine el informe de búsqueda BLASTN. El informe incluye: 
12. Informe Resumen de Búsqueda muestra una visión general de los parámetros de la búsqueda BLASTN.
13. Sección del Gráfico Resumen muestra la alineación de las coincidencias de la base de datos con la secuencia de consulta. El color de las cajas corresponde a la puntuación de la alineación, siendo el rojo el que representa las puntuaciones de alineación más altas.
14. Sección de Descripción muestra todas las secuencias de la base de datos que presentan una homología significativa con nuestra secuencia. Por defecto, los resultados se clasifican de acuerdo con el “E-Value” (Valor E), pero puede hacer clic en el encabezado de columna para ordenar los resultados según diferentes categorías. Observar que puede haber varias entradas diferentes con una idéntica puntuación alta.
15. Sección de Alineamiento muestra bloques con los alineamientos de cada “hit” del programa BLAST. Cada bloque de los alineamientos comienza con un resumen que incluye la “Max score” (puntuación máxima) y el valor esperado, la identidad de la secuencia, el número de huecos en el alineamiento y la orientación de la secuencia de consulta con respecto a la secuencia sujeto.
16. Seleccionar una secuencia para centrarse en un análisis más profundo de la misma. Para ello, hacer clic en la barra de color en la sección Gráfico Resumen, o hacer clic en el nombre de la secuencia en la sección de Descripción, o desplazarse hacia abajo en la sección de Alineamiento. A continuación, hacer clic en el identificador de secuencia. Esto nos lleva a obtener información adicional acerca de la secuencia sujeto, incluyendo el nombre del gen, el género y la especie de origen, y artículos escritos sobre el gen. Después de realizar esta búsqueda, uno de los “hits” debe ser “Bos taurus factor de crecimiento epidérmico (EGFR), ARNm”. Secuencia ID: Ref |XM_002696890.4|. Si la parte superior del “hit” no coincide, volver a entrar la secuencia. Asegurarse que los parámetros de la búsqueda del BLASTN son los correctos.

B) Ejercicios

Ejercicio 1 

Familiarizarse con la autorradiografía mediante la lectura de la secuencia de ADN de la muestra #1.
Comenzar en la flecha y leer hacia arriba el gel durante 20 nucleótidos. Escribir la secuencia de ADN. Buscar la secuencia en la base de datos del NCBI utilizando el programa BLASTN.
Comenzar en la flecha y leer hacia arriba el gel durante 30 nucleótidos. Escribir la secuencia de ADN. Buscar la secuencia en la base de datos del NCBI utilizando el programa BLASTN.
Algunas notas sobre la lectura de un gel de secuenciación:
Se puede introducir la secuencia directamente en el cuadro de consulta o escribir la secuencia en un pedazo de papel y luego entrarla en el cuadro de busqueda.
Es muy importante que no confunda los carriles cuando lea la secuencia. El gel contiene los carriles A, C, G y T de izquierda a derecha.
La lectura de un gel de secuenciación requiere que leer los nucleótidos en la dirección 5’→3’. Esto se puede lograr mediante la lectura hacia "arriba" del gel (a partir de la parte inferior del gel a la parte superior).
Observe que, en general, la separación y la intensidad de la mayor parte de las bandas es bastante constante. Ignore las bandas de colores claros y elegir los sólo el más oscuros. En ocasiones, la secuencia será oscura y los cuatro carriles serán de intensidad relativamente similares. Esto se llama una compresión de la secuencia de ADN y es común cuando hay tramos de G y C. Este tipo de patrón debe ser tratado como una posición ambigua (ver nota siguiente).
Si una banda en una posición exacta es ambigua, puede introducir una N que indica que podría ser cualquiera de las bases: A, C, G o T.

Con los resultados obtenidos de la autorradiografía #1 responder a las siguientes preguntas:

1. ¿Los resultados obtenidos con BLASTN para la primera y la segunda búsqueda se parecen entre sí?
2. ¿Cuál es el nombre de este gen?
3. ¿A qué organismo es probable que pertenezca la secuencia de ADN de este ejercicio? 

Ejercicio 2

Ahora que están familiarizados con el proceso de inscripción y presentación, leer el análisis de la secuencia de ADN de la autorradiografía correspondiente a la muestra #2. Tener en cuenta que a veces es difícil juzgar la distancia y la intensidad más fuerte de la banda en cada carril y por lo tanto es necesario utilizar su mejor juicio.

Comience el ejercicio mediante la lectura de la secuencia de ADN de la muestra #2, aproximadamente 6 cm desde la parte inferior de la tira. Los primeros 12 nucleótidos deben ser: 5'...GGACGACGGTAT...3'.

Buscar la secuencia en la base de datos del NCBI utilizando el programa BLASTN.

Después de obtener los resultados del programa BLASTN, desplácese hacia abajo a la sección de Alineamiento y mirar las entradas que tienen nucleótidos que coinciden con su secuencia de consulta.

Algunas notas adicionales sobre la lectura de un gel de secuenciación y la interpretación de los resultados del BLAST:

Recuerde que la secuencia de ADN siempre se introduce en la dirección 5'→3'.

El ADN es de doble cadena y contiene una parte superior (5'→3') y otra inferior (3'→5') (a veces esto corresponde a las cadenas simples, codificante y no codificante). Cuando una secuencia de consulta se busca en la base de datos se examinan ambas cadenas de la consulta. La secuencia introducida se conoce como la cadena positiva y el complemento inverso de esta secuencia es conocida como la cadena negativa.

Como regla general, las secuencias de nucleótidos idénticos que abarcan más de 21 pares de bases entre dos muestras indica, por lo general, que las secuencias están relacionadas o son idénticas.

Con los resultados obtenidos de la autorradiografía #2 responder a las siguientes preguntas:
¿Cuál es el nombre de este gen?

¿Cuál es la cadena simple que representa la secuencia de consulta? ¿Cuál es la cadena simple que representa la secuencia “hit”?

Ejercicio 3

Lea la secuencia de ADN de la muestra #3. Comenzar desde la parte inferior de la banda y escribir la secuencia de ADN.
Buscar la secuencia en la base de datos del NCBI utilizando el programa BLASTN.
Haga clic en el número de acceso de GenBank de la secuencia hit para acceder a más información sobre la secuencia de ADN y/ gen. 

1. Con los resultados obtenidos de la autorradiografía #3 responder a las siguientes preguntas: 
2. ¿Cuál es el nombre de este gen? 
3. ¿Cuántas pares de bases, aproximadamente, tiene este gen? 

Ejercicio 4 

En esta sección se muestra la interacción de dos proteínas codificadas por dos genes. Las interacciones proteína-proteína desempeñan un papel fundamental en prácticamente todos los procesos en una célula viva.

Por ejemplo, las señales del exterior de una célula están mediadas en el interior de esa célula por las interacciones proteína-proteína de las moléculas de señalización. Este proceso, llamado transducción de señales, es muy importancia en muchos procesos biológicos tales como la división celular y la formación del citoesqueleto celular. En este ejercicio, vamos a utilizar secuencias de ADN para caracterizar dos genes humanos. 

Lea la secuencia de ADN obtenido de la muestra #4. Comenzar desde la parte inferior de la banda y escribir alrededor de 30 pares de bases de la secuencia de ADN.
A continuación, suba alrededor de un tercio de la altura de la tira (~ 14 cm) y leer una parte de esta sección de la secuencia de ADN.
Para este ejercicio limitar la búsqueda a la base de datos de genes humanos. Para ello vaya a "Choose Search Set” (Elija conjunto de búsqueda) y seleccione "Human genomic + transcript” (Genóma humano + transcripción). Ver Guía para el uso de BLASTN, punto 7.
Buscar cada sección de la secuencia de forma individual en la base de datos del NCBI utilizando el programa BLASTN.
Una vez haya identificado el nombre de estos dos genes, realice una búsqueda general de Internet para recoger más información acerca de las dos proteínas.
Con los resultados obtenidos de la autorradiografía #4 responder a las siguientes preguntas:
Este ejercicico contiene dos secuencias de ADN (desde la sección inferior y a partir de la sección central). 

1. ¿Cuáles son los nombres de los genes correspondientes a estas dos secuencias? 
2. ¿Cuáles son las funciones de las dos proteínas codificadas por estos genes? 
3. ¿Cómo interactúan estas dos proteínas en una célula viva?

RESULTADOS

Ejercicio 1

Las secuencias encontradas deberían ser casi idénticas para la primera y segunda búsqueda, pero los valores asociados a cada hit (puntuación máxima, la puntuación total, Valor E, etc.) serán más altos para la segunda búsqueda.
Factor de replicación C.
Mus musculus (Ratón doméstico). 

Ejercicio 2

UEV y dominios del lactato/malato deshidrogenasa.
La secuencia de consulta representa la cadena simple positiva (la secuencia introducida). La secuencia hit representa la cadena negativa (la secuencia inversa complementaria). 

Ejercicio 3 

Rho GTPasa activadora de la proteína 5.  

7933 pb.

Ejercicio 4

La primera secuencia de ADN es la de Bai1. La segunda secuencia es la de Rac1. 

La secuencia Bai1 codifica BAI1, un inhibidor de la angiogénesis específica del cerebro. La angiogénesis implica el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos a partir de vasos pre-existentes, es un proceso normal en el crecimiento, desarrollo y cicatrización de heridas. Sin embargo, la angiogénesis también ha demostrado ser esencial para el crecimiento y la metástasis de tumores sólidos. Con el fin de obtener el suministro de sangre para su crecimiento, las células tumorales son potentemente angiogénicas. La BAI1 se cree que inhibe el nuevo crecimiento de las células de los vasos sanguíneos, por lo que suprime el crecimiento de los glioblastomas (tumores cerebrales malignos). La BAI1 también se cree que funciona en la adhesión celular y transducción de señales en el cerebro. La secuencia Rac1 codifica una pequeña GTPasa llamada RAC1. La RAC1 actúa como un interruptor molecular en las vías de señalización que pueden cambiar la transducción de señales hacia dentro y fuera de una célula. La RAC1 está activo u "ON" cuando se une a una GTP e inactiva u "OFF" cuando se une con a un PIB. La forma inactiva de RAC1 (PIB-forma) se activa mediante el intercambio de GDP por GTP por los factores de cambio de nucleótidos de guanosina (GEFs). La inactivación de la RAC1 se consigue mediante la activación de las proteínas GTPasa (GAP), que revierten la conformación de nuevo a la forma inactiva unida a GDP a través de la hidrólisis del GTP.

En una célula viva, después que la RAC1 se activa mediante la unión de GTP, interactúa con BAI1. Esta interacción en la membrana citoplasmática es crucial para la función de BAI1, ya que se cree que participa en el crecimiento neuronal. La BAI1 también se asocia con otros efectores derivados de las proteínas G Rho pequeñas, que se asocian con la formación de fibras y la citocinesis.

Práctica 13: DETECCIÓN DE MAÍZ TRANSGÉNICO POR PCR

OBJETIVO

El objetivo de este experimento es introducir a los estudiantes en los principios y práctica de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) como herramienta para la detección de organismos modificados genéticamente. 

EXPOSICIÓN DE LOS HECHOS

Vamos a ir al mercado a comprar diferentes productos alimentarios que contiene maíz para ver si pertenece a una variedad normal o transgénica.

Para ello lo primero que haremos será la extracción del ADN de los diferentes alimentos seleccionados:

• Harina de maíz marca A.
• Harina de maíz marca B.
• Harina de Maíz BIO.
• Sémola de maíz.

También pueden utilizarse otros productos con maíz que se decidan (es importante trabajar con muestras pulverizadas, por ejemplo, utilizando un molinillo).
Seguidamente, utilizaremos la MIX de PCR para la detección de maíz transgénico Bt. 

COMPONENTES

• Tampón de electroforesis concentrado 10x                               100 ml
• Agarosa                                                                                           6.0 gr
• Muestras maíz para extracción                                                 4 muestras
• Kit extracción ADN alimentos                                                   para 25 muestras
• MIX PCR Detección maíz transgénico                                           2 x 350 µl
• Control positivo ADN normal                                                     10 µl
• Control positivo ADN transgénico                                                10 µl
• GELSAFE tinción ADN                                                           25 µl
• Tampón de electroforesis 10 X para preparar Tampón de electroforesis 1 X que es el Tampón de trabajo para hacer los geles y el de la cubeta. 

PROTOCOLO

A) EXTRACCIÓN DEL ADN DE ALIMENTOS QUE CONTIENEN MAÍZ

1. Se realizarán 4 grupos de trabajo.
2. Se suministran 4 muestras de alimentos que contiene maíz y se ha de detectar la presencia de ADN de maíz normal o transgénico: 1.Harina de maíz marca A; 2.Harina de maíz marca B; 3.Harina de Maíz BIO; 4.Sémola de maíz. También pueden utilizarse otros productos con maíz que se decidan (es importante trabajar con muestras pulverizadas, por ejemplo, utilizando un molinillo).
3. Para la extracción de las muestras suministradas utilizar 100 mg y para las muestras que se quieran evaluar empezar por 200 mg.

B) REACCIÓN DE LA PCR

NOTA: Utilizar siempre puntas con filtro y cambiar de punta cada vez que se realiza una acción para evitar contaminaciones que puede dar lugar a falsos resultados.

Utilizar 2,5 ml (100-250 ng) del ADN de cada extracción de ADN.

IMPORTANTE:

a) Preparar un control negativo de amplificación, para ello colocar 2,5 ml de agua libre de nucleasas en lugar del ADN, esto sirve para saber si los reactivos o micropipetas y puntas pueden estar contaminados con ADN, no se ha de amplificar nada.

b) Preparar un control positivo de amplificación, para ello colocar 2,5 ml del control positivo ADN normal y ADN transgénico.

Las concentraciones típicas de los primers y parámetros utilizados dependerá de cada sistema utilizado. Una concentración final típica de primers es 0,5 µM.

REACTIVOS                           VOLUMEN

• MIX PCR                                22,50 µl
• ADN (100-250 ng)                         2,5 µl
• Volumen Total                            25 µl

Mezclar bien, el colorante rojo está incluido en la polimerasa facilita el proceso.

Realizar el proceso de amplificación.

IMPORTANTE: Para la activación de la Polimerasa “HOT STAR” es necesario programar un paso de desnaturalización inicial de 10 minutos a 95ºC, después programar los 30 o 40 ciclos específicos de cada producto a amplificar.

                                                           PROGRAMA PCR TRANSGENICOS 

                 PASO                                      TEMPERATURA             TIEMPO

Desnaturalización HOT STAR                     95ºC                      10 minutos                                           Ciclos PCR Realizar 35 ciclos                                  95ºC                      30 segundos

                                                                         66ºC                      30 segundos 

                                                                       72ºC                      45 segundos

          Extensión final                                    72ºC                     10 minutos

                  Final                                             4ºC

El producto de la PCR puede ser sembrado directamente en un gel de agarosa 3.0% después de la PCR, ya que el colorante rojo actúa como tampón de carga.

Utilizar el método de detección o tinción del ADN que se use en el laboratorio. Le recomendamos el uso del GELSAFE suministrado con el kit.

RESULTADOS

1: Marcador de peso molecular.
2: Control positivo ADN normal.
3: Control positivo ADN normal.
4: Control positivo ADN transgénico.
5: Control positivo ADN transgénico. 

Se presenta un ejemplo de resultado de la amplificación de los controles positivo ADN normal y ADN transgénico que se suministran en el kit. Podemos observar en el caso de maíz normal la única banda de 226 pb y en el caso de maíz transgénico la presencia de las 2 bandas.
Se observa también un fragmento de mayor tamaño que se trata de una amplificación inespecífica pero que no afecta al resultado, y la formación de dímeros de primers, cosa muy habitual y que es la unión de los primers formando fragmentos mayores.

PROTOCOLO DE EXTRACCIÓN DE ADN A PARTIR DE 100-200 mg DE ALIMENTOS QUE CONTIENEN MAÍZ

Dada la gran variedad de muestras que abarcan los alimentos que contienen maíz se hace difícil presentar un protocolo universal para todas las muestras.

El principal y más importante paso para obtener buenos rendimientos es una buena rotura y homogenización de la muestra que será específica para cada tipo de muestra. En todos los casos y para una mayor efectividad se debería utilizar nitrógeno líquido para pulverizar la muestra.
En muestras sólidas en polvo (harinas, etc.) homogenizar con un homogenizador eléctrico de mano; En muestras sólidas de gran tamaño (copos de maíz, chocolate, galletas, etc) utilizar un molinillo de café para pulverizar una muestra grande y luego pesar la cantidad requerida de polvo.

1. Pesar 100-200 mg de la muestra en un microtubo de 2.0 ml y añadir 1.2 ml de Tampón CTAB-1. Vortex vigorosamente. Incubar a 70ºC durante 30 minutos. Repetir el vortex varias veces durante la incubación. En las muestras suministradas en el kit pesar sólo 100 mg.
2. Centrifugar a 14.000 rpm durante 10 minutos. Aparecerá un pellet y en la superficie una capa de grasa, introducir la punta de pipeta atravesando esta capa superficial, intentando recoger sólo 600 µl de sobrenadante que es el líquido transparente con color (evitar coger pellet y capa superficial) y colocar en un microtubo de 1.5 ml.
3. Añadir 300 µl del Tampón de Lisis/ Unión + 25 µl Proteinasa K a los 600 µl de sobrenadante. Mezclar bien. Incubar a 70ºC durante 10 minutos.
4. Añadir 225 µl de Isopropanol. Mezclar bien.
5. Añadir la mitad del líquido en el reservorio de la Spin microcolumna con su tubo de recogida. Centrifugar a 10.000 rpm durante 60 segundos. Eliminar el tubo de recogida.
6. Repetir el punto N.5 con el líquido restante.
7. Colocar la MicroSpin columna en un nuevo tubo de recogida y añadir al reservorio 500 µ de Tampón de Desinhibición. Centrifugar a 12.000 rpm durante 60 segundos. Eliminar el líquido.
8. Añadir 500 µl de Tampón de Lavado en el reservorio de la Spin microcolumna. Centrifugar a 12.000 rpm durante 60 segundos. Eliminar el líquido. 
9. 2º Lavado. Añadir 500 µl de Tampón de Lavado en el reservorio de la Spin microcolumna. Centrifugar a 14.000 rpm durante 60 segundos. Eliminar el líquido.
10. Centrifugar a máxima velocidad durante 3 minutos para eliminar el etanol residual.
11. Eliminar el tubo de recogida e insertar la spin microcolumna en un microtubo de 1.5 ml. Añadir 150 µl de Tampón de elución (precalentado a 70ºC) en el centro de la membrana blanca. Incubar 2 minutos.
12. Centrifugar a máxima velocidad durante 60 segundos. El microtubo contiene ahora el ADN.

Práctica 12: Electroforesis básica

OBJETIVO

El objetivo de este experimento es introducir a los alumnos en el conocimiento de la teoría electroforética y familiarizarse con los procedimientos implicados en la electroforesis en gel de agarosa para separar moléculas biológicas. En este caso se utilizarán colorantes que simularán fragmentos de ADN haciendo más vistoso el gel.

COMPONENTES

• Tampón de electroforesis concentrado: 10 X (2 envases 500ml) 2 x 50 ml
• Agarosa: 1.75 gr
• Micropipeta 20 microlitros: 1
• Rack de puntas: 1
• Microtubos de muestras: 7

Añadir 450 ml de agua destilada a cada envase de Tampón de electroforesis 10 X para elaborar 2 x 500 ml de Tampón de electroforesis 1 X que es el Tampón de trabajo.

 PROCEDIMIENTO

 PREPARACIÓN GEL DE AGAROSA

A) Preparación del molde

1. Coger el molde para hacer los geles y cerrar los extremos con los topes para que no se salga la agarosa. Después colocar el peine para formar los pocillos.

B) Preparación del gel de agarosa

1. Utilizar un vaso o erlenmeyer de 100 ml para preparar la solución del gel
2. Para geles de 7 x 7 cm: Añadir 32 gr de Tampón de electroforesis 1 X más 0.30 gr de agarosa, agitar la mezcla para disolver los grumos de agarosa. Para geles de 7 x 10 cm: Añadir 42 gr de Tampón de electroforesis 1 X más 0.40 gr de agarosa, agitar la mezcla para disolver los grumos de agarosa.
3.  
4. Asegurarse que se ha añadido los 450 ml de agua destilada al Tampón de electroforesis 10 X.
5. Calentar la mezcla para disolver la agarosa, el método más rápido es la utilización de un microondas, también puede utilizarse un placa calefactora, en ambos casos, para que la agarosa se disuelva se ha de llevar la solución a punto de ebullición. La solución final debe aparecer clara sin partículas aparentes.
6. Enfriar la solución de agarosa más o menos a 55ºC (para acelerar el proceso se puede enfriar colocando el envase debajo de un grifo de agua y agitar). Si se produce mucha evaporación del líquido, añadir tampón de electroforesis.
7. Añadir la solución de agarosa al molde.
8. Permitir que el gel solidifique. Para acelerar el proceso se puede sembrar el gel en una nevera (si la electroforesis se realizará al día siguiente, conservar el gel a 4ºC).

C) Preparación del gel para la electroforesis

1. Después que el gel se ha solidificado con mucho cuidado sacar los topes.
2. Colocar el gel en la cámara de electroforesis correctamente orientada con los pocillos más cerca del polo negativo (color negro).
3. Llenar la cámara de electroforesis con 300 ml de Tampón de electroforesis. El tampón de electroforesis se puede utilizar para 2 experimentos de electroforesis, una vez terminada la electroforesis guardar este tampón utilizado en un envase diferente al suministrado para utilizarlo en una nueva electroforesis.
4. Asegurarse que el gel está completamente cubierto de tampón.
5. Sacar el peine que ha formado los pocillos con mucho cuidado de no romper ningún pocillo.
6. Proceder a la siembra del gel y llevar a cabo la electroforesis.

SIEMBRA DEL GEL Y ELECTROFORESIS

Nota: Si usted no está familiarizado con la siembra de geles de agarosa, es recomendable que practique la siembra antes de llevar a cabo el experimento, o llevar a cabo el experimento completo antes de realizarlo con los alumnos.

A) Muestras de electroforesis

Chequear el volumen de las muestras. Algunas veces pequeñas gotas de la muestra puede estar en las paredes de los microtubos. Asegurarse de que toda la cantidad de muestra se encuentra uniforme antes de sembrar el gel. Centrifugar brevemente los microtubos de muestra, o golpear los microtubos contra una mesa para obtener toda la muestra en la parte inferior del microtubo.

Se suministran 7 muestras diferentes presentadas en 7 tubitos cada uno de un color, sembrar o cargar las muestras en el siguiente orden:

POCILLO             MUESTRA

     1                       Verde

     2                       Negro

     3                       Lila

     4                       Blanco

     5                       Amarillo

     6                       Rojo

     7                       Azul

 Sembrar 20 microlitros de cada muestra, utilizar para ello la micropipeta de volumen fijo que se suministra con una punta de pipeta.  

B) Llevar a cabo la electroforesis

1. Después que se han sembrado las muestras, cuidadosamente colocar la cubierta del aparato de electroforesis en los terminales de los electrodos.
2. Insertar la clavija del cable negro en la entrada de color negro de la fuente de corriente (entrada negativa). Insertar la clavija del cable rojo en la entrada de color rojo de la fuente de corriente (entrada positiva).
3. Configurar la fuente de corriente a 75 voltios (30 minutos) o a 150 voltios (20 minutos) . Vigilar que los colorantes no salen fuera del gel.
4. Después de 10 minutos empezará a observarse la separación de los colorantes.
5. Después de que la electroforesis ha terminado, apagar la fuente de corriente, desconectar los cables y sacar la cubierta.
6. Colocar el gel en un transiluminador de luz blanca (si no se dispone, una hoja de papel blanco también puede utilizarse).

 RESULTADOS

 Las moléculas cargadas viajaran a través de la electroforesis según su carga y tamaño. Mientras que la forma es importante en el caso de biomoléculas (ADN y proteínas), en el caso de los colorantes no es un factor a tener en cuenta.

Una mezcla de colorantes, fragmentos de ADN o proteínas puede ser separadas en una electroforesis (pocillos 1-2-3-4).

Todos los colorantes utilizados tienen una carga negativa.

El color no afecta a la movilidad. El color que se observa en el gel es el color real del colorante.