Práctica 12: Electroforesis básica

OBJETIVO

El objetivo de este experimento es introducir a los alumnos en el conocimiento de la teoría electroforética y familiarizarse con los procedimientos implicados en la electroforesis en gel de agarosa para separar moléculas biológicas. En este caso se utilizarán colorantes que simularán fragmentos de ADN haciendo más vistoso el gel.

COMPONENTES

• Tampón de electroforesis concentrado: 10 X (2 envases 500ml) 2 x 50 ml
• Agarosa: 1.75 gr
• Micropipeta 20 microlitros: 1
• Rack de puntas: 1
• Microtubos de muestras: 7

Añadir 450 ml de agua destilada a cada envase de Tampón de electroforesis 10 X para elaborar 2 x 500 ml de Tampón de electroforesis 1 X que es el Tampón de trabajo.

 PROCEDIMIENTO

 PREPARACIÓN GEL DE AGAROSA

A) Preparación del molde

1. Coger el molde para hacer los geles y cerrar los extremos con los topes para que no se salga la agarosa. Después colocar el peine para formar los pocillos.

B) Preparación del gel de agarosa

1. Utilizar un vaso o erlenmeyer de 100 ml para preparar la solución del gel
2. Para geles de 7 x 7 cm: Añadir 32 gr de Tampón de electroforesis 1 X más 0.30 gr de agarosa, agitar la mezcla para disolver los grumos de agarosa. Para geles de 7 x 10 cm: Añadir 42 gr de Tampón de electroforesis 1 X más 0.40 gr de agarosa, agitar la mezcla para disolver los grumos de agarosa.
3.  
4. Asegurarse que se ha añadido los 450 ml de agua destilada al Tampón de electroforesis 10 X.
5. Calentar la mezcla para disolver la agarosa, el método más rápido es la utilización de un microondas, también puede utilizarse un placa calefactora, en ambos casos, para que la agarosa se disuelva se ha de llevar la solución a punto de ebullición. La solución final debe aparecer clara sin partículas aparentes.
6. Enfriar la solución de agarosa más o menos a 55ºC (para acelerar el proceso se puede enfriar colocando el envase debajo de un grifo de agua y agitar). Si se produce mucha evaporación del líquido, añadir tampón de electroforesis.
7. Añadir la solución de agarosa al molde.
8. Permitir que el gel solidifique. Para acelerar el proceso se puede sembrar el gel en una nevera (si la electroforesis se realizará al día siguiente, conservar el gel a 4ºC).

C) Preparación del gel para la electroforesis

1. Después que el gel se ha solidificado con mucho cuidado sacar los topes.
2. Colocar el gel en la cámara de electroforesis correctamente orientada con los pocillos más cerca del polo negativo (color negro).
3. Llenar la cámara de electroforesis con 300 ml de Tampón de electroforesis. El tampón de electroforesis se puede utilizar para 2 experimentos de electroforesis, una vez terminada la electroforesis guardar este tampón utilizado en un envase diferente al suministrado para utilizarlo en una nueva electroforesis.
4. Asegurarse que el gel está completamente cubierto de tampón.
5. Sacar el peine que ha formado los pocillos con mucho cuidado de no romper ningún pocillo.
6. Proceder a la siembra del gel y llevar a cabo la electroforesis.

SIEMBRA DEL GEL Y ELECTROFORESIS

Nota: Si usted no está familiarizado con la siembra de geles de agarosa, es recomendable que practique la siembra antes de llevar a cabo el experimento, o llevar a cabo el experimento completo antes de realizarlo con los alumnos.

A) Muestras de electroforesis

Chequear el volumen de las muestras. Algunas veces pequeñas gotas de la muestra puede estar en las paredes de los microtubos. Asegurarse de que toda la cantidad de muestra se encuentra uniforme antes de sembrar el gel. Centrifugar brevemente los microtubos de muestra, o golpear los microtubos contra una mesa para obtener toda la muestra en la parte inferior del microtubo.

Se suministran 7 muestras diferentes presentadas en 7 tubitos cada uno de un color, sembrar o cargar las muestras en el siguiente orden:

POCILLO             MUESTRA

     1                       Verde

     2                       Negro

     3                       Lila

     4                       Blanco

     5                       Amarillo

     6                       Rojo

     7                       Azul

 Sembrar 20 microlitros de cada muestra, utilizar para ello la micropipeta de volumen fijo que se suministra con una punta de pipeta.  

B) Llevar a cabo la electroforesis

1. Después que se han sembrado las muestras, cuidadosamente colocar la cubierta del aparato de electroforesis en los terminales de los electrodos.
2. Insertar la clavija del cable negro en la entrada de color negro de la fuente de corriente (entrada negativa). Insertar la clavija del cable rojo en la entrada de color rojo de la fuente de corriente (entrada positiva).
3. Configurar la fuente de corriente a 75 voltios (30 minutos) o a 150 voltios (20 minutos) . Vigilar que los colorantes no salen fuera del gel.
4. Después de 10 minutos empezará a observarse la separación de los colorantes.
5. Después de que la electroforesis ha terminado, apagar la fuente de corriente, desconectar los cables y sacar la cubierta.
6. Colocar el gel en un transiluminador de luz blanca (si no se dispone, una hoja de papel blanco también puede utilizarse).

 RESULTADOS

 Las moléculas cargadas viajaran a través de la electroforesis según su carga y tamaño. Mientras que la forma es importante en el caso de biomoléculas (ADN y proteínas), en el caso de los colorantes no es un factor a tener en cuenta.

Una mezcla de colorantes, fragmentos de ADN o proteínas puede ser separadas en una electroforesis (pocillos 1-2-3-4).

Todos los colorantes utilizados tienen una carga negativa.

El color no afecta a la movilidad. El color que se observa en el gel es el color real del colorante.