martes, 29 de mayo de 2018

Práctica 14: ADN - Informático


OBJETIVO

En esta práctica, los estudiantes explorarán la popular herramienta BLAST bioinformatics. En primer lugar se leerán las autorradiografías de secuenciaciones automáticas de geles. A continuación, se analizaran los datos resultantes utilizando las bases de datos disponibles al público (BLAST) para identificar los genes y productos genéticos.

COMPONENTES

Esta práctica contiene un total de 3 series de 4 autorradiografías de secuenciaciones automáticas de geles. Los estudiantes pueden utilizar cualquier base de datos de secuencias para llevar a cabo las actividades de esta práctica En este protocolo se ha utilizado la base de datos ofrecida por el Centro Nacional de Información Biotecnológica, NCBI (National Center for Biotechnology Information).

COMPONENTES
  1. Autorradiografías de secuenciaciones automáticas de geles          3 grupos de 4 autorad.
  2. A) Material requerido y no suministrado
  3. Una computadora con acceso a Internet.
  4. White Light Box (caja de luz blanca).
NOTA: Se recomienda como caja de luz blanca el sistema EDVOTEK GelVisualization Luz Blanca, ya que consideramos que es muy adecuado para esta práctica.

NOTA: Las autorradiografías también pueden ser colocadas en un retroproyector y ser mostradas a toda la clase.

DESCRIPCIÓN DEL EXPERIMENTO

En esta práctica, los estudiantes explorarán la popular herramienta BLAST bioinformatics. En primer lugar se leerán las autorradiografías de secuenciaciones automáticas de geles. A continuación, se analizaran los datos resultantes utilizando las bases de datos disponibles al público (BLAST) para identificar los genes y productos genéticos.

PROTOCOLO

A) Guía para el uso de BLASTN


  1. Escriba: www.ncbi.nlm.nih.gov para iniciar sesión en la página web del NCBI.
  2. En la parte superior izquierda de la pantalla, haga clic en el apartado Resources” (Recursos) del menú desplegable.
  3. Haga clic en "Data & Software” (Datos y software), a continuación, haga clic en “BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)”.
  4. En la nueva pantalla de inicio, seleccione "nucleotide blast” (Nucleótido blast), que es la opinión primera opción de la lista “BLAST Basic”.
  5. En la nueva pantalla asegúrese de que la pestaña seleccionada es "BLASTN".
  6. Introduzca la secuencia de nucleótidos en la caja grande en la sección "Enter Query Sequence” (Entrar secuencia a consultar); tenga cuidado al escribir la siguiente secuencia exactamente:                                                                                ggcaactgcccaaagtgtgatccagcctgtctcaacagaa
  7. En “Chosse Search Set” (Elija conjunto de búsqueda) asegúrese que se ha seleccionado “Others (nr etc.)" (Otros (nr etc.)) y que "Nucleotide collection (nr/ nt)” (Colección de nucleótidos (nr/nt)) aparece en el menú desplegable. Las entradas restantes deben dejarse en blanco.
  8. En la sección "Program Selection” (Selección del programa) seleccionar “Highly similar sequences (megablast)" (Secuencia de alta similitud (megablast)).
  9. Haga clic en el cuadro de consulta azul "BLAST".
  10. Una vez se ha hecho click en el cuadro de búsqueda "BLAST", se le asignará un ID#. Anotar este número para poder comprobar los resultados en un momento posterior.
  11. Examine el informe de búsqueda BLASTN. El informe incluye: 
  12. Informe Resumen de Búsqueda muestra una visión general de los parámetros de la búsqueda BLASTN.
  13. Sección del Gráfico Resumen muestra la alineación de las coincidencias de la base de datos con la secuencia de consulta. El color de las cajas corresponde a la puntuación de la alineación, siendo el rojo el que representa las puntuaciones de alineación más altas.
  14. Sección de Descripción muestra todas las secuencias de la base de datos que presentan una homología significativa con nuestra secuencia. Por defecto, los resultados se clasifican de acuerdo con el “E-Value” (Valor E), pero puede hacer clic en el encabezado de columna para ordenar los resultados según diferentes categorías. Observar que puede haber varias entradas diferentes con una idéntica puntuación alta.
  15. Sección de Alineamiento muestra bloques con los alineamientos de cada “hit” del programa BLAST. Cada bloque de los alineamientos comienza con un resumen que incluye la “Max score” (puntuación máxima) y el valor esperado, la identidad de la secuencia, el número de huecos en el alineamiento y la orientación de la secuencia de consulta con respecto a la secuencia sujeto.
  16. Seleccionar una secuencia para centrarse en un análisis más profundo de la misma. Para ello, hacer clic en la barra de color en la sección Gráfico Resumen, o hacer clic en el nombre de la secuencia en la sección de Descripción, o desplazarse hacia abajo en la sección de Alineamiento. A continuación, hacer clic en el identificador de secuencia. Esto nos lleva a obtener información adicional acerca de la secuencia sujeto, incluyendo el nombre del gen, el género y la especie de origen, y artículos escritos sobre el gen. Después de realizar esta búsqueda, uno de los “hits” debe ser “Bos taurus factor de crecimiento epidérmico (EGFR), ARNm”. Secuencia ID: Ref |XM_002696890.4|. Si la parte superior del “hit” no coincide, volver a entrar la secuencia. Asegurarse que los parámetros de la búsqueda del BLASTN son los correctos.


B) Ejercicios

Ejercicio 1 

Familiarizarse con la autorradiografía mediante la lectura de la secuencia de ADN de la muestra #1.
Comenzar en la flecha y leer hacia arriba el gel durante 20 nucleótidos. Escribir la secuencia de ADN. Buscar la secuencia en la base de datos del NCBI utilizando el programa BLASTN.
Comenzar en la flecha y leer hacia arriba el gel durante 30 nucleótidos. Escribir la secuencia de ADN. Buscar la secuencia en la base de datos del NCBI utilizando el programa BLASTN.
Algunas notas sobre la lectura de un gel de secuenciación:
Se puede introducir la secuencia directamente en el cuadro de consulta o escribir la secuencia en un pedazo de papel y luego entrarla en el cuadro de busqueda.
Es muy importante que no confunda los carriles cuando lea la secuencia. El gel contiene los carriles A, C, G y T de izquierda a derecha.
La lectura de un gel de secuenciación requiere que leer los nucleótidos en la dirección 5’→3’. Esto se puede lograr mediante la lectura hacia "arriba" del gel (a partir de la parte inferior del gel a la parte superior).
Observe que, en general, la separación y la intensidad de la mayor parte de las bandas es bastante constante. Ignore las bandas de colores claros y elegir los sólo el más oscuros. En ocasiones, la secuencia será oscura y los cuatro carriles serán de intensidad relativamente similares. Esto se llama una compresión de la secuencia de ADN y es común cuando hay tramos de G y C. Este tipo de patrón debe ser tratado como una posición ambigua (ver nota siguiente).
Si una banda en una posición exacta es ambigua, puede introducir una N que indica que podría ser cualquiera de las bases: A, C, G o T.

Con los resultados obtenidos de la autorradiografía #1 responder a las siguientes preguntas:
  1. ¿Los resultados obtenidos con BLASTN para la primera y la segunda búsqueda se parecen entre sí?
  2. ¿Cuál es el nombre de este gen?
  3. ¿A qué organismo es probable que pertenezca la secuencia de ADN de este ejercicio? 


Ejercicio 2

Ahora que están familiarizados con el proceso de inscripción y presentación, leer el análisis de la secuencia de ADN de la autorradiografía correspondiente a la muestra #2. Tener en cuenta que a veces es difícil juzgar la distancia y la intensidad más fuerte de la banda en cada carril y por lo tanto es necesario utilizar su mejor juicio.
Comience el ejercicio mediante la lectura de la secuencia de ADN de la muestra #2, aproximadamente 6 cm desde la parte inferior de la tira. Los primeros 12 nucleótidos deben ser: 5'...GGACGACGGTAT...3'.
Buscar la secuencia en la base de datos del NCBI utilizando el programa BLASTN.
Después de obtener los resultados del programa BLASTN, desplácese hacia abajo a la sección de Alineamiento y mirar las entradas que tienen nucleótidos que coinciden con su secuencia de consulta.
Algunas notas adicionales sobre la lectura de un gel de secuenciación y la interpretación de los resultados del BLAST:
Recuerde que la secuencia de ADN siempre se introduce en la dirección 5'→3'.
El ADN es de doble cadena y contiene una parte superior (5'→3') y otra inferior (3'→5') (a veces esto corresponde a las cadenas simples, codificante y no codificante). Cuando una secuencia de consulta se busca en la base de datos se examinan ambas cadenas de la consulta. La secuencia introducida se conoce como la cadena positiva y el complemento inverso de esta secuencia es conocida como la cadena negativa.
Como regla general, las secuencias de nucleótidos idénticos que abarcan más de 21 pares de bases entre dos muestras indica, por lo general, que las secuencias están relacionadas o son idénticas.
Con los resultados obtenidos de la autorradiografía #2 responder a las siguientes preguntas:
¿Cuál es el nombre de este gen?
¿Cuál es la cadena simple que representa la secuencia de consulta? ¿Cuál es la cadena simple que representa la secuencia “hit”?

Ejercicio 3

Lea la secuencia de ADN de la muestra #3. Comenzar desde la parte inferior de la banda y escribir la secuencia de ADN.
Buscar la secuencia en la base de datos del NCBI utilizando el programa BLASTN.
Haga clic en el número de acceso de GenBank de la secuencia hit para acceder a más información sobre la secuencia de ADN y/ gen. 

  1. Con los resultados obtenidos de la autorradiografía #3 responder a las siguientes preguntas: 
  2. ¿Cuál es el nombre de este gen? 
  3. ¿Cuántas pares de bases, aproximadamente, tiene este gen? 


Ejercicio 4 

En esta sección se muestra la interacción de dos proteínas codificadas por dos genes. Las interacciones proteína-proteína desempeñan un papel fundamental en prácticamente todos los procesos en una célula viva.
Por ejemplo, las señales del exterior de una célula están mediadas en el interior de esa célula por las interacciones proteína-proteína de las moléculas de señalización. Este proceso, llamado transducción de señales, es muy importancia en muchos procesos biológicos tales como la división celular y la formación del citoesqueleto celular. En este ejercicio, vamos a utilizar secuencias de ADN para caracterizar dos genes humanos. 
Lea la secuencia de ADN obtenido de la muestra #4. Comenzar desde la parte inferior de la banda y escribir alrededor de 30 pares de bases de la secuencia de ADN.
A continuación, suba alrededor de un tercio de la altura de la tira (~ 14 cm) y leer una parte de esta sección de la secuencia de ADN.
Para este ejercicio limitar la búsqueda a la base de datos de genes humanos. Para ello vaya a "Choose Search Set” (Elija conjunto de búsqueda) y seleccione "Human genomic + transcript” (Genóma humano + transcripción). Ver Guía para el uso de BLASTN, punto 7.
Buscar cada sección de la secuencia de forma individual en la base de datos del NCBI utilizando el programa BLASTN.
Una vez haya identificado el nombre de estos dos genes, realice una búsqueda general de Internet para recoger más información acerca de las dos proteínas.
Con los resultados obtenidos de la autorradiografía #4 responder a las siguientes preguntas:
Este ejercicico contiene dos secuencias de ADN (desde la sección inferior y a partir de la sección central). 
  1. ¿Cuáles son los nombres de los genes correspondientes a estas dos secuencias? 
  2. ¿Cuáles son las funciones de las dos proteínas codificadas por estos genes? 
  3. ¿Cómo interactúan estas dos proteínas en una célula viva?


RESULTADOS

Ejercicio 1

Las secuencias encontradas deberían ser casi idénticas para la primera y segunda búsqueda, pero los valores asociados a cada hit (puntuación máxima, la puntuación total, Valor E, etc.) serán más altos para la segunda búsqueda.
Factor de replicación C.
Mus musculus (Ratón doméstico). 

Ejercicio 2

UEV y dominios del lactato/malato deshidrogenasa.
La secuencia de consulta representa la cadena simple positiva (la secuencia introducida). La secuencia hit representa la cadena negativa (la secuencia inversa complementaria). 

Ejercicio 3 

Rho GTPasa activadora de la proteína 5.  
7933 pb.

Ejercicio 4

La primera secuencia de ADN es la de Bai1. La segunda secuencia es la de Rac1. 
La secuencia Bai1 codifica BAI1, un inhibidor de la angiogénesis específica del cerebro. La angiogénesis implica el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos a partir de vasos pre-existentes, es un proceso normal en el crecimiento, desarrollo y cicatrización de heridas. Sin embargo, la angiogénesis también ha demostrado ser esencial para el crecimiento y la metástasis de tumores sólidos. Con el fin de obtener el suministro de sangre para su crecimiento, las células tumorales son potentemente angiogénicas. La BAI1 se cree que inhibe el nuevo crecimiento de las células de los vasos sanguíneos, por lo que suprime el crecimiento de los glioblastomas (tumores cerebrales malignos). La BAI1 también se cree que funciona en la adhesión celular y transducción de señales en el cerebro. La secuencia Rac1 codifica una pequeña GTPasa llamada RAC1. La RAC1 actúa como un interruptor molecular en las vías de señalización que pueden cambiar la transducción de señales hacia dentro y fuera de una célula. La RAC1 está activo u "ON" cuando se une a una GTP e inactiva u "OFF" cuando se une con a un PIB. La forma inactiva de RAC1 (PIB-forma) se activa mediante el intercambio de GDP por GTP por los factores de cambio de nucleótidos de guanosina (GEFs). La inactivación de la RAC1 se consigue mediante la activación de las proteínas GTPasa (GAP), que revierten la conformación de nuevo a la forma inactiva unida a GDP a través de la hidrólisis del GTP.
En una célula viva, después que la RAC1 se activa mediante la unión de GTP, interactúa con BAI1. Esta interacción en la membrana citoplasmática es crucial para la función de BAI1, ya que se cree que participa en el crecimiento neuronal. La BAI1 también se asocia con otros efectores derivados de las proteínas G Rho pequeñas, que se asocian con la formación de fibras y la citocinesis.

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