Práctica 16: Southern Blot

1. ELECTROFORESIS DEL GEL DE AGAROSA

a) Preparar el gel

Preparar un gel de agarosa al 0,8% para la electroforesis de las muestras lista para ser sembradas. Utilizar  un  gel  de  7x7  cm  o  7x10  cm.  Se  necesitan  6  pocillos  con  una capacidad de 40 µl.

b) Antes de la siembra de las muestras

1. En  un  baño  calentar  un  vaso  a  65ºC  para  calentar  las  muestras  que  contienen  el  ADN antes de su siembra. A 65ºC las agregaciones no específicas que se pueden generar por los extremos cohesivos generados por los enzimas de restricción son eliminadas.
2. Calentar las muestras A-E a 65ºC durante 2 minutos. Permitir enfriar las muestras otros 2 minutos.

c) Sembrar las muestras

Sembrar  las  muestras  A-E  en  pocillos  consecutivos.  La  cantidad  de  muestra  a  siembra debe ser de 35-58 µl.

d) Correr el gel

1. Después  de  la  siembra,  configurar  la  fuente  de  electroforesis  al  voltaje  requerido.  Una vez terminada la electroforesis proceder con el análisis de Soutern Blot.
2. La  electroforesis  debería  pararse  cuando  el  colorante  naranja  de  carga  haya  migrado aproximadamente 4,5 cm desde el pocillo de siembra del gel de agarosa.

2. ANÁLISIS DE SOUTHERN BLOT

Durante este proceso se transferirán los fragmentos de ADN desde el gel de agarosa a la membrana de nylon. Después de la trasferencia, la membrana será incubada durante un periodo  corto  de  tiempo para  fijar  el  ADN  a  la  membrana.  Para  evitar  reactivos TOXICOS,  y  especialmente  los  radioactivos, que  son  utilizados  en  el  Southern, en  este  experimento  se  utilizará  un  sistema  de  detección  no isotópico especialmente diseñado para su uso escolar.

a) Despurinización/Desnaturalización

1. Después  de  la  electroforesis,  el  gel  es  secuencialmente  tratado  con  HCl  y  NaoH.  El  HCl introduce sitios  apurínicos  en  el  ADN  lo  cual  produce  uniones  fosfodiester  e  introduce “nicks”  en  el  ADN de  doble  cadena.  El  tratamiento  con  NaOH  rompe  los  puentes  de hidrógeno  entre  las  bases.  El secuencial  tratamiento  ácido/base  resulta  en  la  formación de  pequeños  fragmentos  que  facilita  la trasferencia  de  los  fragmentos  de  ADN  en  la membrana de nylon.
2. Después  de  la  electroforesis  colocar  el  gel  de  agarosa  en  una  cubeta  con  100  ml  de 0,25  N HCl.  Incubar  a  temperatura  ambiente  durante  8  minutos  (no  sobrepasar  este tiempo).  El  gel  debe estar  completamente  cubierto  con  la  solución  y  agitar periódicamente.
3. Eliminar  con  cuidado  la  solución,  que  no  se  podrá  reutilizar.  Lavar  el  gel  con  diversos cambios de 100 ml de agua destilada.
4. Colocar el gel durante 15 minutos en la solución  de Desnaturalización del ADN (0,5 M NaOH/0,6  M NaCl).  El  gel  debe  estar  completamente  cubierto  con  la  solución  y  agitar periódicamente. Eliminar la solución.
5. Utilizar  otros  100  ml  de  Solución  de  Desnaturalización  e  incubar  otros  15  minutos. Conservar está solución para el punto 6.
6. Configurar la transferencia del Southern Blot
7. Colocar  unas  hojas  de  papel  de  plástico,  de  aluminio  o  papel  “whatman”  en  una superficie plana del laboratorio. Sacar el gel e invirtiendo el gel (los pocillos hacia abajo), colocar  la  superficie  lisa de  forma  que  quede  en  contacto  con  la  membrana  de transferencia.
8. Utilizando  siempre  guantes,  con  pinzas  y  tijeras  ajustar  la  membrana  de  nylon  al tamaño del gel. Aquellas zonas de la membrana tocadas sin guantes dejarán residuos de aceite  y  no  permitirán unir  el  ADN  durante  la  transferencia.  Muchos  guantes  contienen polvo lo que aumentará el “background” en la membrana, colocarse los guantes y lavarse con agua para eliminar el polvo.
9. Recoja con mucho cuidado la membrana por los extremos con 2 pinzas y ligeramente doblada  en  el centro  y  lentamente  humedecer  (desde  la  mitad  hacia  afuera)  con  la solución de Desnaturalización del punto 4.
10. Liberar  la  membrana  y  sumergir  suavemente  durante  5  minutos  en  la  solución  de Desnaturalizción.  Utilizando  unas  pinzas  sacar  la  membrana  saturada  de  la  Solución  de Desnaturalización y colocarla encima del gel de agarosa.
11. Es  MUY  IMPORTANTE  que  entre  los  diferentes  elementos  del  dispositivo  no queden burbujas de aire.
12. Recorte  el  papel  de  filtro  de  blotting  del  mismo  tamaño  del  gel  y  la  membrana  de nylon. Colocar  el  papel  de  filtro  encima  de  la  membrana.  Cuidadosamente,  colocar  un montón de papel absorbente 4-5 cm de grosor encima del filtro de “blotting”. Colocar una bandeja o placa de cristal y colocar por ejemplo un vaso de 400 ml vacío como peso.
13. Permitir que la transferencia progrese durante 4 horas o toda la noche.
14. Eliminar la placa de vidrio, vaso y papeles absorbentes.
15. Con  guantes  enjuagados  y  pinzas  voltear  el  conjunto  (gel-nylon-papel  de  filtro)  de forma que descanse sobre el papel de filtro.
16. Utilizando  un rotulador  dibujar  los 6 pocillos de muestra  y rastrear  sus posiciones  en la membrana de nylon
17. Utilizando  pinzas  retirar  el  gel  de  la  membrana.  El  gel  puede  ser  descartado  y  se observará que está deshidratado
18. Poner la membrana encima de un montón de papel seco con el ADN  hacía arriba (el lado que estuvo en contacto con el gel).
19. Marcar la membrana por el lado del ADN con el nº de grupo o nombre
20. Para  unos  resultados  óptimos,  secar  y  fijar  el  ADN  completamente  a  la  membrana.
21. Para ello colocar la membrana entre dos hojas de papel de filtro y colocar a 80ºC durante 30 minutos.

3. DETECCIÓN NO-ISOTÓPICA DEL ADN

1. Durante  este  proceso  se  podrá  visualizar  el  ADN  en  la  membrana.  El  “Blue  Blot  DNA Stain”  es un  reactivo  no-isotópico  desarrollado  para  su  uso  a  nivel  escolar,  que  elimina los problemas asociados al uso de isótopos radiactivos.
2. Colocar  la  membrana  con  el  ADN  en  100  ml  de  la  solución  diluida de  “Blue  Blot  DNA Stain” durante 10-15 minutos.
3. Sacar la membrana con pinzas y colocar en 200 ml de agua destilada.
4. Cambiar  el  agua  destilada  3  o  4  veces  hasta  que  la  membrana  está  desteñida  y  las bandas de ADN son claramente visibles.

 

RESULTADOS Y PREGUNTAS

Los  resultados  reales  producen  bandas  más  amplias  de  diferentes  intensidades.  El esquema muestra las posiciones relativas aproximadas de las bandas pero los resultados no están descritos a escala. Alguna de las bandas pequeñas puede no ser visible.

Pocillo1 A: Fragmentos estándar ADN

Pocillo2 B: ADN de madre cortado con enzima.

Pocillo3 C: Hijo cortado con enzima.

Pocillo4 D: Padre 1 cortado con enzima.

Pocillo5 E: Padre 2 cortado con enzima.

Preguntas previas

1. ¿Por qué el Southern Blot es un análisis requerido para pruebas forenses o de paternidad? 

La  digestión  de  los  cromosomas  humanos  con  enzimas  de  restricción produce  gran  cantidad  de fragmentos  de  ADN  que  no  pueden  ser  separados  por electroforesis  convencional.  Además,  los geles  son  difíciles  de  almacenar  y  frágiles  para exponer  a  agentes  desnaturalizantes.  La transferencia  de  las  bandas  de  ADN  a  una membrana  de  nylon  produce  una  imagen  espejo  de los  fragmentos  de  ADN.  De  esta forma los fragmentos transferidos a la membrana pueden ser desnaturalizados.

2.  ¿Cuál  es  la  función  de  las  sondas  en  el  análisis  de  paternidad? 

Sondas específicas  pueden  ser  desarrolladas  para  determinar  la  presencia  de  los  lugares  de restricción.  Las  sondas  pueden  hibridar  con  uno  o  más  fragmentos  generados  por  los enzimas de restricción.

3. ¿Por qué se utiliza más de un locus en un test de paternidad?

Se utilizan varias sondas para asegurar que el test determina diferentes diferencias alélicas en un individuo dado que se puede correlacionar con la suma tanto de su padre y su madre.

4. ¿Cuál es el padre en esta prueba de paternidad?

 Padre 1.

5. ¿Se demuestra que la madre también es la madre biológica?

Sí.