Práctica 9: Criopreservación.

Objetivo

Congelar las células cultivadas previamente en frigorífico de -80ºC y criopreservarlas después en nitrógeno líquido.

Material y equipo:

1. Centrífuga.
2. Medio de congelación: Suero fetal bovino (FBS) y dimetil sulfóxido (DMSO).
3. Pipetas serológicas graduadas de 5, 10 y 25ml, según sea necesario.ç
4. Auxiliar de macropipeteado.
5. Micropipetas de 10 a 100μl y puntas estériles correspondientes.
6. Tubos Falcon de 15 y 50ml.
7. Unidades de filtración de distintos volúmenes (según la cantidad de nedui de congelación que se quiera preparar).
8. Tubos y cajas de criopreservación.
9. Gradilla para tubos.
10. EtOH at 70% para desinfectar.

Entorno y requisitos previos.

1. Encender la cabina de flujo laminar.
2. Desinfectar el material con EtOH al 70%
3. Una vez que se está trabajando dentro de la cabina, no se debe de sacar las manos sin cerrar botellas o tubos, para evitar posibles contaminaciones.

Recuento celular: se realiza como viene descrito en el apartado de conteo, concentración y viabilidad celular.

Cálculos para determinar el número de viales a congelar.

Por lo general, se congelarás del orden de 3,5x10^6 de células por vial. Para calcular el número de viales a congelar por un cultivo, se calculará el número total de células y posteriormente se dividirá entre el número de células por vial.

Criopreservación de células.

1. Etiquetar los viales de criopreservación (Nº de células, estático y fecha)
2. Introducir el cultivo en tubos Falcon de 15ml.
3. Centrifugar (80xg, 8 minutos) e introducir los tubos en la cabina de flujo.
4. Con una micropipeta quitar todo el sobrenadante,
5. Resuspender el pellet en el volumen de medio de congelación necesario: este volumen será de 1ml de medio de congelación por vial.
6. Con una pipeta serológica tomar todo el volumen (1ml) y añadirlo al vial de criopreservación.
7. Introducir los viales de criopreservación en el congelador de -20ºC durante 4-5 horas. Este tiempo es muy importante para ue el proceso de congelación vaya bien.
8. Una vez pasado el tiempo, meter los viales en una de las cajas de criopreservción y llevarlos al frigorífico de -80ºC o al Deward de nitrógeno líquido.

                             

           

Práctica 8: Conteo,concentración y viabilidad celular.

Objetivo.

 

Calcular los parámetros de concentración y viabilidad de un cultivo celular.

 

Descripción.

 

Material y equipo.

1. Cámara de Neubauer.
2. Contadores manuales (2).
3. Disolución al 0,4 % de Tripan Blue.
4. Microscopio Óptico invertido.

Pipeta serológica graduada de 5,10 ó 25 ml, según sea necesario.

1. Auxiliar de macropipeteado.
2. Micropipetas de 10 a 100 uL y puntas estériles correspondientes.
3. Tubos Eppendorf de 1,5 ml.
4. Gradilla para tubos.
5. EtOH al 70% para esterelizar. 

Entorno y requisitos previos.

1. Encender la cabina de flujo laminar.
2. Desinfectar el material con EtOH al 70%.
3. Una vez que se está trabajando dentro de la cabina, no se debe sacar las manos sin cerrar botellas o tubos, para evitar posibles contaminaciones.  

Procedimiento. Conteo, concentración y viabilidad celular.

1. Una vez homogeneizado el cultivo a caracterizar, dentro de la cabina se toman 50 μL de muestra del cultivo y se añaden a un tubo eppendorf.
2. Trabajar fuera de la cabina y añadir igual cantidad de disolución al 0,4% Tripan Blue.
3. Resuspender 1 ó 2 veces con cuidado de no deteriorar las células.
4. A continuación, una vez que la muestra esté preparada, se procede a realizar el recuento celular en cámara Neubauer. 

                 a) Se coloca un cubreobjetos sobre la cámara de Neubauer, y se situa en posición horizontal sobre la mesa, en un lugar donde nos sea cómodo pipetear.

                         b)Con una micropipeta, tomamos 10 μL de muestra.

                         c) Se coloca la punta de la micropipeta en el borde del cubreobjetos, en el extremo de la cámara de Neubaur e introducimos la muestra entre la cámara y el cubreobjetos desde el lateral.

                        d) En caso de que aparezcan burbujas, el cubreobjetos se haya movido o algo no haya salido bien, repetir la operación.

                       e) Se coloca la cámara de Neubaur en la bandeja del microscopio.

                       f) Enfocar el microscopio hasta que puedan verse nítidas las células mirando por el binocular. Buscar el primer cuadro donde vaya a realizarse el recuento. En cámara vamos a contar 5 cuadros grandes. 

                       g) Existe una convención por la cual si las células tocan el limite superior o el limite izquierdo del cuadro, deben contabilizarse, pero no se contabilizan si tocan el limite inferior o el limite derecho.

                       h) Se efectúan un conteo en forma de zig-zag.

                       i)Se procede al contaje de las células viables( sin teñir) y de las células no viables (teñidas de azul). En una hoja de resultados anotamos el número total de células contadas en los 5 cuadrados.

   

  5. La determinación de la concentración celular viene definida por la ecuación:

      Concentración (células/ml)  = Nº de células x 10000/ Nº de cuadros x Dilución.

  6. La viabilidad celular, viene definida por la ecuación :
       
       Viabilidad celular (%) = (N º de células viables/ Nº de células totales) x 100.

  

 

 

 

 

 

Práctica 7: Kit de bacterias.

Componentes del kit

Equipos y reactivos necesarios y no provistos

• Isopropanol
• Etanol 100%
• Microcentrífuga
• Microtubos de 1,5ml 

Protocolo

• Disolver la proteinasa K en 1,10ml de agua libre de nucleasas (kit de 50 extracciones) y en 5,25ml /kit de 250 extracciones) y conservar a -20ºC. Se recomienda realizar varias alícuotas para evitar demasiados ciclos de descongelado-congelado. A esta temperatura es estable durante 1 año.
• Disolver la lisozima en 1,10ml de agua libre de nucleasas (kit de 50 extracciones) y en 5,25ml kit de 250 extracciones) y conservar a -20ºC. Se recomienda realizar varias alícuotas para evitar demasiados ciclos de descongelado-congelado. A esta temperatura es estable durante 1 año.
• Verificar que el Tampón de Lisis/Unión no tiene precipitados debido a las bajas temperaturas. Si es necesario, disolver calentando a 37ºC.
• Añadir Etanol 100% al Tampón de Desinhibición indicado en la etiqueta, unos 10ml (kit de 50 extracciones) y unos 50ml (kit de 250 extracciones). Mantener el envase cerrado para evitar la evaporación del etanol.
• Añadir el Etanol 100% al Tampón de Lavado indicado en la etiqueta, unos 40ml (kit de 50 extracciones) y unos 200ml (kit de 250 extracciones). Mantener el envase bien cerrado para evitar la evaporación del Etanol,
• Pre-calentar el Tampón de Elución a 70ºC.

Protocolo de extrección de ADN bacteriano a partir de 1-1,5ml de medio de pre-enriquecimiento o enriquecimiento.

1. Transferir 1-1,5ml de medio de pre-enriquecimiento o enriquecimiento a un microtubo de 1,5ml y centrifugar 5 minutos a 12.000-14.000 rpm. Eliminar el sobrenadante.
2. Añadir 280μl del Tampón de Reacción Lisozima + 20μl Lisozima. Mezclar bien con micropipeta para resuspender el pellet bacteriano. Incubar a 37ºC durante 30 minutos.
3. Añadir 300μl de Tampón de Lisis/Unión + 20μl de Proteinasa K. Mezclar bien. Incubar a 70ºC durante 10 minutos.
4. Añadir 150μl de Isopropanol. Mezclar bien y centrifugar 60 segundos a 14.000 rpm.
5. Añadir el sobrenadante en el reservorio de la Spin microcolumna con su tubo de recogida. Centrifugar a 8.000 rpm durante 60 segundos. Eliminar el tubo de recogida.
6. Colocar la microSpin columna en un nuevo tubo de recogida y añadir al reservorio 500μl de Tampón de Desinhibición. Centrifugar a 8.000 rpm durante 60 segundos. Eliminar el líquido.
7. Añadir 500μl de Tampón de Lavado en el reservorio de la Spin microcolumna. Centrifugar a 12.000 rom durante 60 segundos. Eliminar el líquido.
8. 2º lavado. Añadir 500μl de Tampón de Lavado en el reservorio de la Spin microcolumna. Centrifugar a 14.000 rom durante 60 segundos. Eliminar el líquido.
9. Centrifugar a máxima velocidad durante 2 minutos para eliminar el etanol residual.
10. Eliminar el tubo de recogida e insertar la spin microcolumna en un microtubo de 1,5ml. Añadir 100μl de Tampón de elución (precalentado a 37ºC) en el reservorio de la spin microcolumna. Incubar 1 minuto.
11. Centrifugar a máxima velocidad durante 60 segundos. El microtubo contiene ahora el ADN bacteriano.

Práctica 6: Extracción de ADN en sangre.

Inventario:

• Muestra de sangre.
• Tampón de Lisis.
• NaCl 0,9%
• SDS 20%
• Proteinasa K 20mg/ml.
• NaCl saturado (6M).
• Etanol absoluto.
• Etanol 70%
• 2 microtubos.
• 1 Tubo de fondo cónico 15ml.
• 1 Varilla para capturar la madeja de ADN.
• 2 Pipetas pasteur de 3ml.

Protocolo de extracción de ADN.

1. Partir de 2ml de sangre periférica en EDTA.
2. Añadir 10ml de Tampón de Lisis. Mezclar por inversión.
3. Dejar en la nevera (4ºC) durante 30 minutos.
4. Centrifugar 15 minutos a 2500 rpm.
5. Eliminar el sobrenadante con pipeta pasteur o mediante decantación.
6. Añadir el precipitado NaCl 0,9% hasta 4ml. Disolver completamente el precipitado.
7. Centrifugar 15 minutos a 2500 rpm.
8. Eliminar el sobrenadante con pipeta pasteur o mediante decantación.
9. Añadir al precipitado 500μl de Tampón de Lisis, 25μl de SDS 20% y 2,5μl de Proteinasa K. Agitar con vórtex (opcional).
10. Incubar a temperatura ambiente toda la noche.
11. Añadir 160μl de NaCl saturado. Dar un pulso con vórtex (opcional).
12. Añadir el doble de volumen que haya en ese momento de etanol absoluto frío. Mezclar por inversión muy lentamente observando la formación del ovillo de ADN precipitado.
13. Capturar la madeja de ADN con una varilla.
14. LAvar la madeja en un microtubo con 1ml de etanol 70%.
15. Dejar secar el ADN en la varilla durante 30 minutos, apoyando la varilla sobre una gradilla. Pasar la varilla a un microtubo vacío.
16. Resuspender en 300μl agua destilada estéril. Con este procedimiento se obtiene una concentración de ADN promedio de 100-200ng/μl.

Práctica 5: Preparación de Tapón de Lisis.

Tampón de Lisis.

Preparación de 500ml:

1. Pesar cada uno de los reactivos según las cantidades especificadas en la tabla anterior (menos el Tritón).
2. Añadir agua (para uso en biología molecular, suministrada en el kit) hasta 400ml.
3. Disolver en agitador magnético. Si es necesario, facilitar la disolución mediante la aplicación de calor suave durante la agitación. Una vez disuelta la sacarosa y el resto de reactivos, añadir el Tritón-X100 y disminuir la velocidad de agitación para evitar la formación de demasiada espuma.
4. Ajustar a pH=7,5 (HCl).
5. Añadir agua hasta 500ml.

Almacenamiento: Almacenar a 4ºC, durante no más de 15 días.

Precauciones: Esta solución no puede ser autoclavada una vez preparada.

Práctica 4: Extracción a partir de muestras de 600μl de saliva directa.

Toma de muestras:

Depositar aproximadamente 1,5 ml de saliva en un envase de recogida. Se recomienda no haber comido nada durante los 30 minutos previos a la toma de muestras. Para ello pasar la lengua con movimientos arriba-abajo por las paredes de las mejillas, mandíbulas y paladar, para recoger las células.

Lisis celular.

1. Colocar 600-800μl de saliva en un microtubo de 1,5 ml. Centrifugar durante 90s a 13.000-16.000 x g. Eliminar el sobrenadante con pipeta sin dañar el pellet blanco visible de células.
2. Añadir 600μl de tampón de lisis. Resuspender mediante arriba y abajo con la micropipeta para disolver el pellet de células y lisarlo. (Resuspender completamente el pellet sin que se observe ningún grumo blanco, ya que si no, la cantidad de ADN obtenida será pequeña).
3. Incubar durante 10 minutos. Agitar los tubos suavemente durante 2 minutos. Si es posible, incubar a 37ºC, ya que esto mejorará el rendimiento.

Precipitación proteica.

1. Añadir 200μl de Tampón de Precipitación de proteínas al lisado celular.
2. Vortex vigorosamente a máxima velocidad durante 20-30s.
3. Centrifugar a 13.000-16.000 x g durante 5 minutos. Se formará un precipitado. Si se observan partículas flotando, volver a centrifugar después de incubar 5 minutos en hielo.

Precipitación del ADN.

1. Traspasar el sobrenadante que contiene ADN a un microtubo nuevo que contiene 600μl de Isopropanol.
2. Mezclar por inmersión unas 25-50 veces.
3. Centrifugar a 13.000-16.000 x g durante 2 minutos. El ADN será visible como un pellet blanco.
4. Eliminar el sobrenadante y secar el tubo de forma breve en papel absorbente. Añadir 600μl de Etanol 70% para lavar el ADN.
5. Centrifugar a 13.000-16.000 x g durante 1 minuto. Cuidadosamente eliminar el sobrenadante sin tocar el pellet de ADN. Volver a centrifugar brevemente para recoger las últimas gotas de Etanol residual, y con una micropipeta y punta fina, recoger el Etanol residual.
6. Invertir el microtubo en un papel absorbente y secar durante unos 5-10 minutos.

Hidratación del ADN.

1. Añadir 100-750μl de Tampón de Hidratación, dependiendo del tamaño de pellet de ADN y resuspender con micropipeta. Los pellet de gran tamaño, es posible que necesiten una incubación a 55ºC durante 1 hora para resuspender completamente antes de llevar a cabo la PCR. Para pellet muy pequeños se pueden utilizar 25-50μl de Tampón de Hidratación.
2. Conservar a 2-8ºC. Para almacenajes largos conservar a -20ºC o -80ºC.

Práctica 3: Lavado de manos

Objetivo.

Aprender a realizar un correcto lavado de manos, lo que nos permitirá trabajar de manera higiénica en el laboratorio.

Fundamento.

Para trabajar en el laboratorio de biología molecular, es necesario mantener unas condiciones de higiene adecuadas, no solo para evitar contaminarnos nosotros, sino para evitar la contaminación de las muestras que manipulamos. Por tanto, el proceso de lavado de manos se llevará a cabo siempre antes y después de la jornada de trabajo; además en cualquier momento a lo largo de la práctica, siempre que sea necesario, hubiera un derrame o salgamos del laboratorio.

Procedimiento.

Para explicar el procedimiento del lavado de manos, nos basaremos en las recomendaciones que nos ofrece la Organización Mundial de la Salud (OMS) sobre esta práctica.

1. Mojarse las manos con agua.
2. Depositar en la palma de la mano una cantidad de jabón suficiente para cubrir toda la superficie de la mano.
3. Frotarse las palmas de las manos entre sí.
4. Frotarse la palma de la mano derecha contra el dorsal de la mano izquierda entrelazando los dedos y viceversa.
5. Frotarse las palmas de las manos entre sí, con los dedos entrelazados.
6. Frotarse el dorso de los dedos de una mano con la palma de la mano opuesta, agarrándose los dedos.
7. Frotarse con un movimiento de rotación el pulgar izquierdo, atrapándolo con la palma de la mano derecha y viceversa.
8. Frótese la punta de los dedos de la mano derecha contra la palma de la mano izquierda, haciendo un movimiento de rotación y viceversa.
9. Enjuáguese las manos con agua.
10. Secarse con una toalla desechable.
11. Ayudarse de la toalla para cerrar el grifo.
12. Las manos ya están preparadas para trabajar y para ponerse los guantes estériles y manipular el material.

Práctica 2: Normas de trabajo y desinfección de la cabina de flujo laminar.

Objetivo.

Aprender el manejo de la cabina de flujo laminar y realización de una limpieza correcta de la misma, con el fin de poder trabajar adecuadamente en sucesivos procesos de forma estéril.

Fundamento.

Antes del uso de la cabina de flujo laminar (CFL) realizaremos una limpieza para asegurarnos de que trabajamos en las condiciones adecuadas, para ello utilizaremos los desinfectantes adecuados.

Del mismo modo, tras el uso adecuado de la CFL en el laboratorio, necesitaremos dejarla en condiciones adecuadas de limpieza para poder trabajar al día siguiente. Se aplican para ella desinfectantes para eliminar la presencia de suciedad y microorganismos, posteriormente se aplica radiación ultravioleta (UV).

Forma del trabajo.

• La puerta del recinto permanecerá cerrada para evitar corrientes de aire y mantener las condiciones de asepsia.
• La cabina se conectará al menos 15 minutos antes de empezar la elaboración de las preparaciones.
• Se introducirá en la CFL todo el material estéril.

                    ·Antes de introducir ningún material, se pulverizan y limpian con alcohol de 70º.
                    ·El material se dispondrá en los laterales de la zona de trabajo y alejados entre 10-15cm, tanto del borde exterior de la cabina, como de la rejilla protectora del filtro HEPA, hay que procurar no ocupar más de 1/3 de la superficie de la mesa de trabajo, dejando el área central libre para realizar manipulaciones.
                    ·El material limpio o preparado para ser usado suele colocarse a la izquierda y el que ya está usado o los desechos a la derecha.

• Una vez introducido, colocado y preparado todo el material, es recomendable dejar unos 5 minutos antes de empezar a trabajar, para que el flujo laminar retire la posible contaminación transportada del exterior.
• Las operaciones se llevarán a cabo dentro del margen de seguridad (15 cm hacia dentro de la cabina), en el centro del área de trabajo.
• Durante este proceso el operador tendrá en cuenta unas normas para no alterar el flujo de aire y con ello la posible contaminación por partículas y/o microorganismos del ambiente de la cabina:

                     ·Minimizar los movimientos dentro y fuera de la cabina (no levantarse hasta terminar, no sacar las manos de la cabina…)

                     ·Evitar trabajar con los codos apoyados en la superficie de la CFL.
                     ·Si el material se rompe en la cabina se retirará con cuidado, evitando que queden restos y sin movimientos bruscos.
                     ·Evitar la proyección de líquidos sobre el filtro HEPA, cuando se abran ampollas, como cuando se ajuste el volumen de las jeringas.

• Desde que se colocan los guantes no entrarás en contacto con material o sustancia no estéril.
• El asiento que se utiliza para trabajar deberá tener ruedas que permitan acomodarse, acercarse y alejarse de la zona de trabajo de la cabina, sin necesidad del uso de las manos.

Procedimientos generales de limpieza y desinfección de la CFL.

1. El ventilador de la cabina estará funcionando.
2. Utilizar tejidos estériles de un solo uso, humedecidos con desinfectante.
3. Limpieza con agua jabonosa y aplicación de un nuevo desinfectante (alcohol 70º).
4. No verter agua ni otros líquidos directamente en la zona de trabajo, limpiar con ayuda de trapos húmedos.
5. Con una gasa estéril y guantes se realizará el arrastre siguiendo el sentido del flujo del aire y desde las áreas de menor a mayor contaminación.
6. No mojar el filtro HEPA.
7. Durante la limpieza de la zona contaminada se llevará bata protectora y guantes de látex de un solo uso.
8. Todo el material utilizado en la limpieza deberá considerarse residuo contaminado.
9. La limpieza y desinfección deberá realizarse en los siguientes casos:

                ·Antes de comenzar cualquier trabajo en la cabina.

                ·Una vez finalizado el trabajo en la cabina.

                ·Siempre que cambie el programa de trabajo.

                ·En caso de producirse derrames.

Reactivos:

• Alcohol 70º.
• Solución jabonosa.

Materiales:

• Gasas estériles.
• Guantes

Actividades:

1. El aire en la cabina de flujo laminar, ¿desde dónde hacia dónde se dirige? Desde dentro de la cabina hacia fuera.
2. ¿Por qué se recomienda dejar el material limpio que se va a usar a la izquierda y el que se ha usado o el de desecho a la derecha? Para no contaminar la muestra, no pasando el brazo por encima de ella.

Práctica 1: Limpieza y esterilización del material de vidrio.

Objetivo → La realización de una limpieza correcta del material fungible con el fin de poder trabajar adecuadamente en sucesivos procesos de forma estéril.

Fundamento → Tras el uso del material de vidrio en el laboratorio necesitamos dejarlo en condiciones adecuadas de limpieza para poder trabajar al día siguiente, siguiendo los procedimientos de control adecuados. Para ello aplicamos desinfectantes para eliminar la presencia de microorganismos y la suciedad, posteriormente le aplicaremos una técnica de esterilizacíon por calor húmedo.

Reactivos:

• Agua destilada
• Solución jabonosa

Procedimiento de limpieza

1. Limpiar el material de vidrio cin agua jabonosa. Podemos usar agua fría, templada o caliente.
2. Para aplicar el agua jabonosa dispondremos de escobillones o estropajos con los que frotaremos el material por dentro y por fuera, intentando no dejar restos visibles.
3. Realizar varios aclarados con agua del grifo.
4. Aplicar el último aclarado con agua destilada.

Materiales para esterilización

• Escobillones y estropajos
• Bolsas de esterilización
• Control de esterilización 
• Autoclave
• Frascos lavadores

Preparación del material para esterilizar

1. Dejar escurrir o secar en la estufa, o secar a mano.
2. Una vez limpio el material lo introduciremos en bolsas especiales de autoclave.
3. Las bolsas se cortan de un tamaño algo mayor que el material a envolver para que nos permita sellarlo con la selladora.
4. Primero sellaremos un extremo, después introducimos el material y el testigo, y finalmente sellaremos el otro extremo.

Preparación del autoclave

1. Llenamos el depósito del autoclave con agua hasta la medida indicada (siempre pro debajo de la rejilla). Comprobar que la llave del agua está cerrada.
2. Poner el material sobre la rejilla (no demasiado apelmazado para que circule el vapor).
3. Cerrar la tapa de forma hermética.
4. Comprobar que está conectado a la corriente.
5. Colocar la temperatura y presión deseada, o marcar el programa que se desea colocar (1atm, 120ºC, 15 minutos). 
6. Iniciar el proceso.
7. Pasados unos minutos cerrar la llave de purga del aire.
8. Puede tardar unos 30 minutos en alcanzar la temperatura y presión deseada. Dejar actuar. Una vez que finalice no podrá abrirse hasta que la presión haya bajado a 0 atm y la temperatura esté por debajo de 50ºC.
9. Abrir la llave de vapor (no la del agua).
10. Dejar enfriar el material.
11. Colocar el material estéril en su sitio.

Actividades: 

1. ¿Por qué hay que cerrar la llave de paso de purga después de conectar y cerrar el autoclave? Para que a medida que se genere vapor, el aire que hay dentro del autoclave vaya saliendo por la llave de purga.
2. ¿Cuál es el motivo por el que hay que limpiar el material antes de esterilizarlo? Para eliminar los microorganismos más grandes.

Práctica 0: Pipeteo de microvolúmenes

Inventario.

• Colorante I.
• Colorante II.
• Gradilla de 32 pocillos.
• Guantes.
• Micropipetas.
• Puntas desechables para micropipetas.

La gradilla de pocillos se divide en dos zonas, cada una de ellas específica para un ejercicio.

Ejercicio 1: Se realizará en la parte superior de la gradilla.

1. Pipetear 40μl del tubo Colorante I en el primer pocillo (esquina superior izquierda).
2. De los 40μl pipeteados en el primer pocillo, pipetear 20μl al segundo pocillo (situado debajo del primero).
3. Del segundo pocillo pipetear 10μl al tercer pocillo.
4. Del primer pocillo pipetear 10μl al cuarto pocillo.
5. Repetir el ejercicio en las otras trescolumnas, hastaconseguir un manejo correcto de la micropipeta.

Ejercicio 2: se realizará en la parte inferior de la gradilla.

1. Pipetear 80μl del tubo Colorante II en el primero pocillo inferior.
2. De los 80μl pipeteados en el primer pocillo, pipetear 40μl al segundo pocillo.
3. Pipetear 20μl del primer pocillo en introducir en el tercer pocillo.
4. Pipetear 20μl del primer pocillo e introducirlo en el cuarto pocillo.
5. Pipetear 20μl de segundo pocillo e introducir en el cuarto pocillo.
6. Repetir el ejercicio en las otras tres columnas, hasta conseguir un manejo correcto de la micropipeta.

Preguntas:

1. ¿Por qué es importante introducir la punta del líquido con el primer tope del émbolo apretado? Porque es necesario expulsar todo el aire para un correcto pipeteo. ¿Por qué es importante sacar la punta del líquido con el segundo émbolo apretado? Para poder sacar todo el líquido que contiene. ¿Afectaría a la práctica el no hacerlo de esta forma? Sí, ya que al tomar aire, estaríamos tomando mal el volumen inicial.
2. ¿Cómo son los volúmenes finales de los pocillos en el primer ejercicio en cada columna? El primer pocillo del ejercicio 1, tiene un volumen de 10μl, y el primer pocillo del ejercicio 2 tiene un volúmen de 0μl.
3. ¿Qué volúmen tiene el primer pocillo del segundo ejercicio al finalizar la práctica? 0μl. ¿Qué significa? Que todo el volúmen contenido en el inicio se ha distribuído en los demás pocillos. ¿Se ha pipeteado inicialmente la cantidad necesaria para hacer el ejercicio? Sí, ya que aunque no haya nada en el primer pocillo, el resto de la actividad se ha podido desarrollar correctamente.
4. ¿Qué volúmen final tiene el cuarto pocillo del segundo ejercicio respecto al tercero? Tiene 20μl más que el tercero. ¿A simple vista habrías asegurado lo mismo? Explica el por qué de este efecto visual. No, es posible asegurar que el cuarto pocillo tiene más volumen pero no exactamente cuanto. Al ser una medida tan pequeña, el menisco que forma puede ser definitivo para llevarnos al error.
5. ¿Qué efecto tendría utilizar una pipeta mal calibrada en la realización de esta práctica? Si se usa una pipeta mal calibrada, los volúmenes tomados son erróneos, por lo que la práctica completa habría salido mal.