Práctica 7: Kit de bacterias.

Componentes del kit

Equipos y reactivos necesarios y no provistos

• Isopropanol
• Etanol 100%
• Microcentrífuga
• Microtubos de 1,5ml 

Protocolo

• Disolver la proteinasa K en 1,10ml de agua libre de nucleasas (kit de 50 extracciones) y en 5,25ml /kit de 250 extracciones) y conservar a -20ºC. Se recomienda realizar varias alícuotas para evitar demasiados ciclos de descongelado-congelado. A esta temperatura es estable durante 1 año.
• Disolver la lisozima en 1,10ml de agua libre de nucleasas (kit de 50 extracciones) y en 5,25ml kit de 250 extracciones) y conservar a -20ºC. Se recomienda realizar varias alícuotas para evitar demasiados ciclos de descongelado-congelado. A esta temperatura es estable durante 1 año.
• Verificar que el Tampón de Lisis/Unión no tiene precipitados debido a las bajas temperaturas. Si es necesario, disolver calentando a 37ºC.
• Añadir Etanol 100% al Tampón de Desinhibición indicado en la etiqueta, unos 10ml (kit de 50 extracciones) y unos 50ml (kit de 250 extracciones). Mantener el envase cerrado para evitar la evaporación del etanol.
• Añadir el Etanol 100% al Tampón de Lavado indicado en la etiqueta, unos 40ml (kit de 50 extracciones) y unos 200ml (kit de 250 extracciones). Mantener el envase bien cerrado para evitar la evaporación del Etanol,
• Pre-calentar el Tampón de Elución a 70ºC.

Protocolo de extrección de ADN bacteriano a partir de 1-1,5ml de medio de pre-enriquecimiento o enriquecimiento.

1. Transferir 1-1,5ml de medio de pre-enriquecimiento o enriquecimiento a un microtubo de 1,5ml y centrifugar 5 minutos a 12.000-14.000 rpm. Eliminar el sobrenadante.
2. Añadir 280μl del Tampón de Reacción Lisozima + 20μl Lisozima. Mezclar bien con micropipeta para resuspender el pellet bacteriano. Incubar a 37ºC durante 30 minutos.
3. Añadir 300μl de Tampón de Lisis/Unión + 20μl de Proteinasa K. Mezclar bien. Incubar a 70ºC durante 10 minutos.
4. Añadir 150μl de Isopropanol. Mezclar bien y centrifugar 60 segundos a 14.000 rpm.
5. Añadir el sobrenadante en el reservorio de la Spin microcolumna con su tubo de recogida. Centrifugar a 8.000 rpm durante 60 segundos. Eliminar el tubo de recogida.
6. Colocar la microSpin columna en un nuevo tubo de recogida y añadir al reservorio 500μl de Tampón de Desinhibición. Centrifugar a 8.000 rpm durante 60 segundos. Eliminar el líquido.
7. Añadir 500μl de Tampón de Lavado en el reservorio de la Spin microcolumna. Centrifugar a 12.000 rom durante 60 segundos. Eliminar el líquido.
8. 2º lavado. Añadir 500μl de Tampón de Lavado en el reservorio de la Spin microcolumna. Centrifugar a 14.000 rom durante 60 segundos. Eliminar el líquido.
9. Centrifugar a máxima velocidad durante 2 minutos para eliminar el etanol residual.
10. Eliminar el tubo de recogida e insertar la spin microcolumna en un microtubo de 1,5ml. Añadir 100μl de Tampón de elución (precalentado a 37ºC) en el reservorio de la spin microcolumna. Incubar 1 minuto.
11. Centrifugar a máxima velocidad durante 60 segundos. El microtubo contiene ahora el ADN bacteriano.