Práctica 8: Conteo,concentración y viabilidad celular.

Objetivo.

 

Calcular los parámetros de concentración y viabilidad de un cultivo celular.

 

Descripción.

 

Material y equipo.

1. Cámara de Neubauer.
2. Contadores manuales (2).
3. Disolución al 0,4 % de Tripan Blue.
4. Microscopio Óptico invertido.

Pipeta serológica graduada de 5,10 ó 25 ml, según sea necesario.

1. Auxiliar de macropipeteado.
2. Micropipetas de 10 a 100 uL y puntas estériles correspondientes.
3. Tubos Eppendorf de 1,5 ml.
4. Gradilla para tubos.
5. EtOH al 70% para esterelizar. 

Entorno y requisitos previos.

1. Encender la cabina de flujo laminar.
2. Desinfectar el material con EtOH al 70%.
3. Una vez que se está trabajando dentro de la cabina, no se debe sacar las manos sin cerrar botellas o tubos, para evitar posibles contaminaciones.  

Procedimiento. Conteo, concentración y viabilidad celular.

1. Una vez homogeneizado el cultivo a caracterizar, dentro de la cabina se toman 50 μL de muestra del cultivo y se añaden a un tubo eppendorf.
2. Trabajar fuera de la cabina y añadir igual cantidad de disolución al 0,4% Tripan Blue.
3. Resuspender 1 ó 2 veces con cuidado de no deteriorar las células.
4. A continuación, una vez que la muestra esté preparada, se procede a realizar el recuento celular en cámara Neubauer. 

                 a) Se coloca un cubreobjetos sobre la cámara de Neubauer, y se situa en posición horizontal sobre la mesa, en un lugar donde nos sea cómodo pipetear.

                         b)Con una micropipeta, tomamos 10 μL de muestra.

                         c) Se coloca la punta de la micropipeta en el borde del cubreobjetos, en el extremo de la cámara de Neubaur e introducimos la muestra entre la cámara y el cubreobjetos desde el lateral.

                        d) En caso de que aparezcan burbujas, el cubreobjetos se haya movido o algo no haya salido bien, repetir la operación.

                       e) Se coloca la cámara de Neubaur en la bandeja del microscopio.

                       f) Enfocar el microscopio hasta que puedan verse nítidas las células mirando por el binocular. Buscar el primer cuadro donde vaya a realizarse el recuento. En cámara vamos a contar 5 cuadros grandes. 

                       g) Existe una convención por la cual si las células tocan el limite superior o el limite izquierdo del cuadro, deben contabilizarse, pero no se contabilizan si tocan el limite inferior o el limite derecho.

                       h) Se efectúan un conteo en forma de zig-zag.

                       i)Se procede al contaje de las células viables( sin teñir) y de las células no viables (teñidas de azul). En una hoja de resultados anotamos el número total de células contadas en los 5 cuadrados.

   

  5. La determinación de la concentración celular viene definida por la ecuación:

      Concentración (células/ml)  = Nº de células x 10000/ Nº de cuadros x Dilución.

  6. La viabilidad celular, viene definida por la ecuación :
       
       Viabilidad celular (%) = (N º de células viables/ Nº de células totales) x 100.