Práctica 4: Extracción a partir de muestras de 600μl de saliva directa.

Toma de muestras:

Depositar aproximadamente 1,5 ml de saliva en un envase de recogida. Se recomienda no haber comido nada durante los 30 minutos previos a la toma de muestras. Para ello pasar la lengua con movimientos arriba-abajo por las paredes de las mejillas, mandíbulas y paladar, para recoger las células.

Lisis celular.

1. Colocar 600-800μl de saliva en un microtubo de 1,5 ml. Centrifugar durante 90s a 13.000-16.000 x g. Eliminar el sobrenadante con pipeta sin dañar el pellet blanco visible de células.
2. Añadir 600μl de tampón de lisis. Resuspender mediante arriba y abajo con la micropipeta para disolver el pellet de células y lisarlo. (Resuspender completamente el pellet sin que se observe ningún grumo blanco, ya que si no, la cantidad de ADN obtenida será pequeña).
3. Incubar durante 10 minutos. Agitar los tubos suavemente durante 2 minutos. Si es posible, incubar a 37ºC, ya que esto mejorará el rendimiento.

Precipitación proteica.

1. Añadir 200μl de Tampón de Precipitación de proteínas al lisado celular.
2. Vortex vigorosamente a máxima velocidad durante 20-30s.
3. Centrifugar a 13.000-16.000 x g durante 5 minutos. Se formará un precipitado. Si se observan partículas flotando, volver a centrifugar después de incubar 5 minutos en hielo.

Precipitación del ADN.

1. Traspasar el sobrenadante que contiene ADN a un microtubo nuevo que contiene 600μl de Isopropanol.
2. Mezclar por inmersión unas 25-50 veces.
3. Centrifugar a 13.000-16.000 x g durante 2 minutos. El ADN será visible como un pellet blanco.
4. Eliminar el sobrenadante y secar el tubo de forma breve en papel absorbente. Añadir 600μl de Etanol 70% para lavar el ADN.
5. Centrifugar a 13.000-16.000 x g durante 1 minuto. Cuidadosamente eliminar el sobrenadante sin tocar el pellet de ADN. Volver a centrifugar brevemente para recoger las últimas gotas de Etanol residual, y con una micropipeta y punta fina, recoger el Etanol residual.
6. Invertir el microtubo en un papel absorbente y secar durante unos 5-10 minutos.

Hidratación del ADN.

1. Añadir 100-750μl de Tampón de Hidratación, dependiendo del tamaño de pellet de ADN y resuspender con micropipeta. Los pellet de gran tamaño, es posible que necesiten una incubación a 55ºC durante 1 hora para resuspender completamente antes de llevar a cabo la PCR. Para pellet muy pequeños se pueden utilizar 25-50μl de Tampón de Hidratación.
2. Conservar a 2-8ºC. Para almacenajes largos conservar a -20ºC o -80ºC.