Práctica 6: Extracción de ADN en sangre.

Inventario:

• Muestra de sangre.
• Tampón de Lisis.
• NaCl 0,9%
• SDS 20%
• Proteinasa K 20mg/ml.
• NaCl saturado (6M).
• Etanol absoluto.
• Etanol 70%
• 2 microtubos.
• 1 Tubo de fondo cónico 15ml.
• 1 Varilla para capturar la madeja de ADN.
• 2 Pipetas pasteur de 3ml.

Protocolo de extracción de ADN.

1. Partir de 2ml de sangre periférica en EDTA.
2. Añadir 10ml de Tampón de Lisis. Mezclar por inversión.
3. Dejar en la nevera (4ºC) durante 30 minutos.
4. Centrifugar 15 minutos a 2500 rpm.
5. Eliminar el sobrenadante con pipeta pasteur o mediante decantación.
6. Añadir el precipitado NaCl 0,9% hasta 4ml. Disolver completamente el precipitado.
7. Centrifugar 15 minutos a 2500 rpm.
8. Eliminar el sobrenadante con pipeta pasteur o mediante decantación.
9. Añadir al precipitado 500μl de Tampón de Lisis, 25μl de SDS 20% y 2,5μl de Proteinasa K. Agitar con vórtex (opcional).
10. Incubar a temperatura ambiente toda la noche.
11. Añadir 160μl de NaCl saturado. Dar un pulso con vórtex (opcional).
12. Añadir el doble de volumen que haya en ese momento de etanol absoluto frío. Mezclar por inversión muy lentamente observando la formación del ovillo de ADN precipitado.
13. Capturar la madeja de ADN con una varilla.
14. LAvar la madeja en un microtubo con 1ml de etanol 70%.
15. Dejar secar el ADN en la varilla durante 30 minutos, apoyando la varilla sobre una gradilla. Pasar la varilla a un microtubo vacío.
16. Resuspender en 300μl agua destilada estéril. Con este procedimiento se obtiene una concentración de ADN promedio de 100-200ng/μl.