Práctica 9: Criopreservación.

Objetivo

Congelar las células cultivadas previamente en frigorífico de -80ºC y criopreservarlas después en nitrógeno líquido.

Material y equipo:

1. Centrífuga.
2. Medio de congelación: Suero fetal bovino (FBS) y dimetil sulfóxido (DMSO).
3. Pipetas serológicas graduadas de 5, 10 y 25ml, según sea necesario.ç
4. Auxiliar de macropipeteado.
5. Micropipetas de 10 a 100μl y puntas estériles correspondientes.
6. Tubos Falcon de 15 y 50ml.
7. Unidades de filtración de distintos volúmenes (según la cantidad de nedui de congelación que se quiera preparar).
8. Tubos y cajas de criopreservación.
9. Gradilla para tubos.
10. EtOH at 70% para desinfectar.

Entorno y requisitos previos.

1. Encender la cabina de flujo laminar.
2. Desinfectar el material con EtOH al 70%
3. Una vez que se está trabajando dentro de la cabina, no se debe de sacar las manos sin cerrar botellas o tubos, para evitar posibles contaminaciones.

Recuento celular: se realiza como viene descrito en el apartado de conteo, concentración y viabilidad celular.

Cálculos para determinar el número de viales a congelar.

Por lo general, se congelarás del orden de 3,5x10^6 de células por vial. Para calcular el número de viales a congelar por un cultivo, se calculará el número total de células y posteriormente se dividirá entre el número de células por vial.

Criopreservación de células.

1. Etiquetar los viales de criopreservación (Nº de células, estático y fecha)
2. Introducir el cultivo en tubos Falcon de 15ml.
3. Centrifugar (80xg, 8 minutos) e introducir los tubos en la cabina de flujo.
4. Con una micropipeta quitar todo el sobrenadante,
5. Resuspender el pellet en el volumen de medio de congelación necesario: este volumen será de 1ml de medio de congelación por vial.
6. Con una pipeta serológica tomar todo el volumen (1ml) y añadirlo al vial de criopreservación.
7. Introducir los viales de criopreservación en el congelador de -20ºC durante 4-5 horas. Este tiempo es muy importante para ue el proceso de congelación vaya bien.
8. Una vez pasado el tiempo, meter los viales en una de las cajas de criopreservción y llevarlos al frigorífico de -80ºC o al Deward de nitrógeno líquido.